本发明涉及用于生产啤酒麦芽汁的方法，所述方法包括向醪液中添加与seq idno:1、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:10具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；以及包含所述变体的淀粉糖化或酿造组合物。
背景技术：
1、谷物淀粉由葡萄糖聚合物组成，其中葡萄糖残基由α-1,4或α-1,6键连接。在酿造中，谷物成分的提取被称为淀粉糖化。在此步骤期间，水被淀粉颗粒吸附，并且淀粉的分子间键逐渐被破坏，直到淀粉不可逆地溶解在水中。启动此过程(称为溶胀)所需的温度取决于淀粉的类型。一些谷物淀粉如大麦或小麦淀粉在58℃-65℃开始溶胀，而其他谷物淀粉如玉米、水稻、高粱淀粉在60℃-85℃之间开始溶胀。在用具有高糊化温度的谷物进行酿造的情况下，典型地会采用并行处理，即所谓的液化或谷物蒸煮，其中通过将其淀粉暴露在85℃-100℃的温度下一段时间以确保淀粉的溶解和液化(典型地使用热稳定α-淀粉酶来实现)。该步骤后，液化的淀粉被调节(通过冷却或与冷麦芽醪液混合)到糖化酶可以将现有的不可发酵的糊精水解成可发酵糖的温度。主要的可发酵糖是葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖，同时也有微量的蔗糖和果糖存在。
2、在不添加外源酶的情况下生产的麦芽汁典型地由65％-80％的可发酵糖和20％-35％的糊精组成。可发酵糖的程度取决于麦芽内源淀粉酶的淀粉分解活性和采用的淀粉糖化方案。由于麦芽内源淀粉分解活性(即β-淀粉酶)的天然限制，总会残留不可发酵的糊精，而这些不可发酵的糊精无法被酿造酵母转化为乙醇。
3、酿酒厂目标是提高单位原料的乙醇产量，同时不显著地改变最终啤酒的感官感受，可以在液化淀粉的糖化步骤中使用商业的普鲁兰酶、淀粉葡糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶及其组合来克服这一限制。此外，低卡路里的啤酒和低残留碳水化合物的啤酒在美国啤酒市场上非常受欢迎，并且最近引起了全球的广泛关注。这样的啤酒的获得原理与使用商业糖化酶相同，但目标是最大限度地水解糊精。
4、商业糖化酶的另一应用领域是使用100％未麦芽化的原料(如大麦、小麦、高粱、玉米、水稻、木薯等)生产麦芽汁。由于这样的原料缺乏或仅含有不足以用于酿造目的的内源淀粉分解活性，必须使用商业淀粉分解酶。关于大麦麦芽的淀粉糖化，淀粉糖化方案设计需要确保将谷物淀粉完全地糊化和液化，并且后续的糖化已进行到一定程度，使麦芽汁中的可发酵糖能够通过酵母达到目标实际发酵程度。
5、对于显示高糊化温度的原料(例如水稻、玉米、高粱)，淀粉糖化方案典型地包括在85℃-100℃温度下的液化步骤，然后在62℃-70℃的较低温度下糖化。这样的方法典型地需要更多时间并且可能需要另外的设备。
6、为了在不影响方法效率的情况下简化和缩短淀粉糖化方法，需要改善的且热稳定性更高的淀粉分解酶。
7、us 3379534描述了通过使用淀粉葡糖苷酶来制备低糊精啤酒。
8、us 4536477描述了热稳定葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶尤其可用于从淀粉制备含葡萄糖的糖浆。
9、wo 2009/075682描述了使用某种普鲁兰酶来生产啤酒麦芽汁，其中淀粉糖化是使用较少量的酶蛋白实现的。
10、matthews等人,2001,journal of institute of brewing[酿造研究所学报]107(3)pp185-194披露了通过在高温下用源自黑曲霉的葡糖淀粉酶进行淀粉糖化来制备低碳水化合物啤酒。
11、wo 2012/140075(诺维信公司(novozymes a/s)，丹麦)披露了用于通过添加某种葡糖淀粉酶来生产啤酒麦芽汁的方法。
技术实现思路
1、诸位发明人发现，某些葡糖淀粉酶的热稳定变体在淀粉糖化(即酿造)方面表现出极大改善的性能。热稳定变体的另一个改善的性能是它们增加了产品的甜度或甜味，从而减少了传统配方中的糖添加量。
2、因此在第一方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括在淀粉液化之前、期间或之后，向醪液中添加与seq id no:1、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:10具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
3、本发明的第二方面涉及淀粉糖化或酿造组合物，这些淀粉糖化或酿造组合物包含如第一方面所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；优选地还包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：α淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、生淀粉降解α淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖氧化酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、β葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、纤维二糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
1.一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括在淀粉液化之前、期间或之后，向醪液中添加与seq id no:1、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:10具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该亲本葡糖淀粉酶来自青霉属的物种，优选地来自草酸青霉、米克青霉、罗氏青霉或光孢青霉。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中该成熟变体在对应于seq id no:1中的位置1、2、4、6、7、11、31、34、50、65、79、103、132、327、445、447、481、484、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含至少一个氨基酸修饰。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的位置1、2、4、11、65、79和327的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的r1a、p2n、p4s、p11f、t65a、k79v和q327f的一个或多个或全部位置处包含取代。
5.根据权利要求3所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的位置1、6、7、31、34、79、103、132、445、447、481、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的r1a、g6s、g7t、r31f、k34y、k79v、s103n、a132p、d445n、v447s、s481p、d566t、t568v、q594r和f595s的一个或多个或全部位置处包含取代。
6.根据权利要求3所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的位置1、6、7、31、34、50、103、132、445、447、481、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的r1a、g6s、g7t、r31f、k34y、e50r、s103n、a132p、d445n、v447s、s481p、e501a、n539p、d566t、t568v、q594r和f595s的一个或多个或全部位置处包含取代。
7.根据权利要求3所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的位置1、6、7、31、34、50、103、132、445、447、481、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于seq id no:1中的r1a、g6s、g7t、r31f、k34y、e50r、s103n、a132p、d445n、v447s、s481p、e501a、n539p、d566t、t568v、q594r和f595s的一个或多个或全部位置处包含取代。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于seqid no:1中的位置1、6、7、31、34、50、79、103、132、445、447、481、484、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于seqid no:1中的r1a、g6s、g7t、r31f、k34y、e50r、k79v、s103n、a132p、d445n、v447s、s481p、t484p、e501a、n539p、d566t、t568v、q594r和f595s的一个或多个或全部位置处包含取代。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该成熟热稳定变体相对于其亲本具有至少5℃，优选地至少6℃、7℃或8℃的热稳定性改善(td)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该成熟热稳定变体与其亲本相比在91℃下具有至少150、优选地至少200、更优选地至少250、最优选地至少300的相对活性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中淀粉糖化包括孵育步骤，该孵育步骤在65℃或更高温度下持续至少20分钟；优选地在67℃或更高温度下持续至少20分钟；甚至更优选地在68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃下或最优选地在87℃或更高温度下持续至少20分钟。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该醪液的ph为约4.6至约6.4。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中与添加热稳定性比权利要求1低的amg酶相比，在更短的糖化时间内达到目标葡萄糖浓度。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，该方法包括还向该醪液中添加一种或多种另外的酶，所述另外的酶选自由以下组成的组：α淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、生淀粉降解α淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖氧化酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、β葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中与该麦芽汁的总碳水化合物含量相比，该麦芽汁具有高于80％的葡萄糖。
16.一种淀粉糖化或酿造组合物，该淀粉糖化或酿造组合物包含如权利要求1-10中任一项所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
17.根据权利要求16所述的淀粉糖化或酿造组合物，该淀粉糖化或酿造组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：α淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、生淀粉降解α淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖氧化酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、β葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
