本发明涉及水产动物病害防控，具体涉及针对神经坏死病毒的纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
1、虽然我国在海水鱼人工繁育方面取得了巨大突破，但形成规模化人工繁育的种类并不多，并且在人工繁育早期会出现鱼苗大量死亡的现象，这也是制约海水鱼养殖与增殖放流规模的主要瓶颈之一。造成海水鱼早期大量死亡的原因之一是神经坏死病毒（nervousnecrosis virus, nnv），此病毒于1989年发现，1990年首次报道。此后，在世界各地相继报道有超过100多种海水鱼携带nnv，有40多种易感鱼类，例如欧洲鲈 (dicentrarchuslabrax)，亚洲海鲈 (lates calcarifer)，各种石斑鱼类 (ephinephelus spp.)，黄带拟鲹(pseudocaranx dentex)，塞内加尔鳎 (solea senegalensis)，大西洋庸鲽(hippoglossus hippoglossus)、大西洋鳕 (gadus morhua)、太平洋鳕（gadusmacrocephalus）等（bandin i and souto s., 2020）。nnv主要在仔稚幼鱼期发病，致死率可达100%，目前，国内外尚无有效的方法可以阻断nnv，这一直是困扰海水鱼育苗的一个瓶颈。
2、研究发现，nnv传播的主要途径之一是通过亲代垂直传播给子代的，卵和精子都可能携带病毒，受精卵孵化前，胚胎受到卵膜保护，且操作方便，是阻断nnv的理想时期，而孵化后的仔稚鱼，在水体中抗逆性较弱，不宜用药。因此，从胚胎开始阻断nnv可以有效避免nnv对仔稚鱼的影响。阻断病毒的药物很多，例如疫苗、小干扰rna（sirna）、干扰素等，其中，rna干扰技术（rnai）在病毒感染性疾病治疗方面的应用受到极大关注（朱作言等，2006），但目前尚无有效的方法可以将这些药物运送到鱼类胚胎中，急需开发一种有效可行的药物传递载体。
3、随着医学领域新技术手段的不断创新，基于蛋白质、脂质体、高分子聚合物、无机材料等多种材料的递送系统已应用于sirna高效率转运的研究中，并在肿瘤靶向诊断和治疗方面取得了重要进展，但sirna的纳米传递技术在水产领域的研究较少。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供针对神经坏死病毒的纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供了的纳米复合物能够有效提高鱼卵的存活率，能够有效应用于水产养殖领域。
2、本发明提供了纳米复合物，其原料由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺和sirna组成，其中：
3、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯亚胺的质量体积比为（5~50）mg：（0.05~1）ml，每100ml所述聚乙烯亚胺含有0.5~2.5μmol的sirna；
4、所述sirna包括如seq id no:1所示核苷酸序列的正义链和如seq id no:2所示核苷酸序列的反义链、如seq id no:3所示核苷酸序列的正义链和如seq id no:4所示核苷酸序列的反义链以及如seq id no:5所示核苷酸序列的正义链和如seq id no:6所示核苷酸序列的反义链中的至少一种；
5、所述纳米复合物的粒径为100~200nm。
6、与现有技术相比，本发明提供的纳米复合物中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，其降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以当它应用在医药和生物材料中时不会有毒副作用，所述sirna能够有效抑制神经坏死病毒，所述聚乙烯亚胺能够更好的与所述sirna形成复合物，进一步提高所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的负载量，各组分之间配合紧密，构建成功的神经坏死病毒的纳米复合物，能够有效进入鱼卵内部，可以在胚胎时期将nnv进行阻断，进而提高鱼苗成活率，从而获得更准确的技术效果。
7、在一些实施例中，所所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯亚胺的质量体积比为25mg：0.1ml，每100ml聚乙烯亚胺含有1.25 μmol的sirna，其中：
8、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000da，所述聚乙烯亚胺的分子量为25000da。
9、在一些实施例中，所述sirna包括如seq id no:1所示核苷酸序列的正义链和如seq id no:2所示核苷酸序列的反义链。
10、在一些实施例中，所述纳米复合物的粒径为160nm。
11、实验表明，采用上述实施例中各组分获得的纳米复合物，由于各组分之间配合效果最为紧密，负载量最好，纳米复合物的粒径最佳，在传递进入鱼卵时效果最佳，从而可以获得最准确的技术效果。
12、本发明还提供了所述纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：
13、包括如下步骤：
14、步骤1、取所述sirna与所述聚乙烯亚胺混合为溶液a，取聚乳酸-羟基乙酸共聚物和有机相溶液混合为溶液b；
15、步骤2、取步骤1中所述溶液a与所述溶液b超声混合；
16、步骤3、取步骤2中所述超声混合后的溶液与外水相溶液再次超声混合；
17、步骤4、取步骤3中所述再次超声混合后的溶液，经过滤、离心后，获得所述纳米复合物。
18、在一些实施例中，所述步骤1中，所述步骤1中，所述溶液a混合采用的溶剂包括水；
19、作为优选地，所述溶液a中所述聚乙烯亚胺的浓度为5vol%~50vol%；
20、更优选的，所述溶液a中所述聚乙烯亚胺的浓度为10vol%。
21、在一些实施例中，所述步骤1中，所述有机相溶液包括氯仿和/或二甲基甲酰胺；
22、作为优选地，所述有机相溶液为氯仿；
23、优选地，所述溶液b中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为1~10mg/ml，在一些实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度可以为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml；；
24、更优选地，所述溶液b中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为5mg/ml。
25、在一些实施例中，所述步骤3中，所述外水相溶液的溶质包括聚乙二醇和/或吐温80；
26、作为优选地，所述外水相溶液的溶质为聚乙二醇；
27、优选地，所述外水相溶液中，聚乙二醇的浓度为1~20mg/ml；
28、更优选地，所述外水相溶液中，聚乙二醇的浓度为10mg/ml。
29、在一些实施例中，所述步骤2和步骤3中，所述溶液a、所述溶液b和所述外水相溶液的体积比为（0.5~2）（1~10）:（1~30）；
30、更优选地，所述溶液a、所述溶液b和所述外水相溶液的体积比为1:5:15。
31、在一些实施例中，所述步骤4中，所述过滤采用超滤，所述离心后还包括采用pbs洗涤获得所述纳米复合物。
32、本发明提供了所述的纳米复合物或所述的制备方法制得的纳米复合物在制备抗神经坏死病毒和/或提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的药物中的应用。
33、本发明提供了抗神经坏死病毒和/或提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的药物，包括所述的纳米复合物或所述的制备方法制得的纳米复合物。
34、本发明提供了提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的方法，包括采用所述药物对鱼卵进行药浴。
35、本发明提供了由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺和sirna组成的纳米复合物，本发明还提供了所述纳米复合物的制备方法及其在制备抗神经坏死病毒和/或提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的药物。本发明通过模拟神经神经坏死病毒，构建神经坏死病毒衣壳蛋白的载体，并在细胞中表达；筛选出能够有效抑制cp表达的sirna，进而构建神经坏死病毒的纳米复合物，在胚胎时期将nnv进行阻断，进而提高鱼苗成活率，进一步为治疗鱼苗早期疾病开辟新的可能性，该方法在水生动物人工繁育领域具有创新性，为水产养殖领域提供了新的思路。
1.纳米复合物，其特征在于，其原料由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺和sirna组成，其中：
2.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述sirna包括如seq id no:1所示核苷酸序列的正义链和如seq id no:2所示核苷酸序列的反义链；
4.权利要求1~3任一项所述纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述溶液a混合采用的溶剂包括水，所述有机相溶液包括氯仿和/或二甲基甲酰胺；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述外水相溶液的溶质包括聚乙二醇和/或吐温80；
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中，所述溶液a、所述溶液b和所述外水相溶液的体积比为（0.5~2）（1~10）:（1~30）；
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述过滤采用超滤，所述离心后还包括采用pbs洗涤获得所述纳米复合物。
9.权利要求1~3任一项所述的纳米复合物或权利要求4~8任一项所述的制备方法制得的纳米复合物在制备抗神经坏死病毒和/或提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的药物中的应用。
10.抗神经坏死病毒和/或提高感染神经坏死病毒鱼卵存活率的药物，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的纳米复合物或权利要求4~8任一项所述的制备方法制得的纳米复合物。
