本发明属于分子生物学和遗传学，具体涉及一种基于pro-ichi对牛基因编辑的方法。
背景技术：
1、单倍体细胞只含有一套染色体，所以单倍体细胞中的基因突变均为显性突变，可应用于哺乳动物细胞层面的基因筛选。自然状态下哺乳动物体内的单倍体细胞只有卵子和精子，卵子与精子结合得到二倍体受精卵，最终发育成一个完整的个体。通过孤雌激活、显微操作去除雌原核等方法可以得到小鼠、牛、羊的单倍体胚胎，由于其基因组在体外会自发地二倍体化，因此通过单倍体胚胎得到单倍体干细胞，再利用流式细胞仪对其单倍体干细胞进行维持，从而得到可长期在体外培养的可用于生物学研究的单倍体胚胎干细胞。
2、已有研究证实，在小鼠中可通过基因编辑后的类精子单倍体细胞，通过卵母细胞胞质注射单倍体干细胞技术（oocyte intracytoplasmic hascs injection，ichi）可制备出基因编辑半克隆小鼠。但此技术应用在牛育种中还存在一定的困难，在重构胚发育的过程中，存在异常的甲基化修饰，这导致重构胚很难发育到囊胚，不能用于后续的半克隆动物的制备。
技术实现思路
1、本发明的目的在于弥补现有技术的不足，对牛进行基因编辑，擦除卵母细胞胞质注射单倍体干细胞技术产生的异常甲基化修饰，获得ichi囊胚，使ichi囊胚能够顺利发育成胚胎，接近体外受精（in vitro fertilization，ivf）得到的囊胚，制备基因编辑牛。
2、本发明提供了一种基于pro-ichi对牛基因编辑的方法，包括如下步骤：
3、对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑，得到基因编辑后的牛ag-haescs；
4、在所述基因编辑后的牛ag-haescs中瞬时表达鱼精蛋白，得到基因编辑后的牛pro-ag-haescs；
5、将所述基因编辑后的牛pro-ag-haescs注入成熟卵母细胞中，得到重构胚；
6、利用离子霉素激活所述重构胚后，使用6-二甲氨基嘌呤孵育，得到牛pro-ichi胚胎。
7、优选的，在所述基因编辑后的牛ag-haescs中瞬时表达鱼精蛋白的方法包括：利用重组载体转染所述基因编辑后的牛ag-haescs；
8、所述重组载体包括酿酒酵母蛋白表达载体和插入所述酿酒酵母蛋白表达载体的鱼精蛋白编码基因。
9、优选的，所述转染的方式包括电转化。
10、优选的，所述离子霉素的浓度为5~10μm；所述激活的时间为5~10min。
11、优选的，所述6-二甲氨基嘌呤的浓度为2~4mm；所述孵育的时间为5~6h。
12、优选的，所述对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑的方式包括将基因编辑系统导入牛孤雄单倍体干细胞中；
13、所述基因编辑系统包括基础载体和导入所述基础载体的引导编辑器和融合蛋白；所述引导编辑器包括待编辑基因的向导rna、引物序列和转录模板序列；所述向导rna包括待编辑基因的间隔序列；
14、所述融合蛋白包括h840a缺口形式的cas9蛋白和逆转录酶。
15、优选的，所述对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑包括：对牛孤雄单倍体干细胞的 mstn基因进行基因编辑。
16、优选的，用于定位所述 mstn基因的间隔序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。
17、本发明还提供了上述技术方案所述的方法在制备基因编辑牛中的应用。
18、优选的，所述应用包括：对得到的牛pro-ichi胚胎进行培养，得到基因编辑囊胚后进行胚胎移植，得到基因编辑牛。
19、有益效果：
20、本发明提供了一种基于pro-ichi对牛基因编辑的方法，包括如下步骤：对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑，得到基因编辑后的牛ag-haescs；在所述基因编辑后的牛ag-haescs中瞬时表达鱼精蛋白，注入成熟卵母细胞中，得到重构胚；利用离子霉素激活所述重构胚后，使用6-二甲氨基嘌呤孵育，得到牛pro-ichi胚胎。本发明瞬时表达鱼精蛋白能够去除卵母细胞胞质注射单倍体干细胞技术产生的重构胚中异常的dna甲基化，具体去除ichi胚胎中异常的组蛋白h3第4位赖氨酸残基三甲基化、组蛋白h3第9位赖氨酸残基三甲基化和组蛋白h3第27位赖氨酸残基三甲基化的修饰，并使细胞核压缩成精子样结构。实施例结果表明，瞬时表达鱼精蛋白后得到的牛pro-ichi胚胎能够顺利发育成囊胚，与体外受精得到的囊胚比率相当。
21、进一步的，本发明将鱼精蛋白编码基因片段插入鱼精蛋白表达载体后，在基因编辑后的牛ag-haescs中瞬时表达，保证了鱼精蛋白仅发挥擦除异常dna甲基化的作用，而不会整合在基因组中造成外源基因的插入。
1.一种基于pro-ichi对牛基因编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述基因编辑后的牛ag-haescs中瞬时表达鱼精蛋白的方法包括：利用重组载体转染所述基因编辑后的牛ag-haescs；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转染的方式包括电转化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子霉素的浓度为5~10 μm；所述激活的时间为5~10 min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述6-二甲氨基嘌呤的浓度为2~4 mm；所述孵育的时间为5~6 h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑的方式包括将基因编辑系统导入牛孤雄单倍体干细胞中；
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述对牛孤雄单倍体干细胞进行基因编辑包括：对牛孤雄单倍体干细胞的mstn基因进行基因编辑。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于定位所述mstn基因的间隔序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.权利要求1~8任一项所述的方法在制备基因编辑牛中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：对得到的牛pro-ichi胚胎进行培养，得到基因编辑囊胚后进行胚胎移植，得到基因编辑牛。
