本发明属于细胞荧光染色，具体涉及一种复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料。
背景技术：
1、细胞染色是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，是以细胞形态学为基础，综合运用化学反应的原理，对细胞内的各种化学成分（如酶类、酯类、糖类、金属元素、蛋白质、核酸等）进行定性、定位、半定量分析的方法。其中，细胞荧光染色技术对于检测复杂基质中的细胞数量极其重要。
2、通常情况下，对于简单基质中（如磷酸盐缓冲体系等）的细胞计数检测可以通过血球计数板来实现，其原理是利用特制的玻璃计数板，在显微镜下对细胞进行统计计数。
3、但是，当样品基质复杂时（如乳汁、全血等），其基质中的蛋白、脂肪等颗粒物会影响显微镜视野中观察到的细胞，从而造成检测结果的偏差。
4、因此，对于复杂基质中的细胞计数，通常需要采用荧光染料特异性地对细胞进行染色，随后通过荧光显微镜对其进行计数分析。此方法好处在于靶标细胞通过荧光染色后显现出荧光信号，而非靶标颗粒（蛋白、脂肪颗粒及其他等）无信号或信号几乎忽略不计。因此，减弱非靶标信号可减少其对检测结果的影响，使得细胞计数的结果更加准确。
5、但现有的细胞荧光染料体系（如溴化乙啶、噻唑橙等）往往存在着染色强度不高、染色效率低（10 min内染色率<70%）、染色速率慢（通常染色时间>30 min）、荧光染料不稳定（易发生荧光猝灭）、毒性高等缺点，从而可造成细胞计数结果偏低、染色操作复杂、环境污染等问题。
6、目前现有的一款较为优秀的商业化荧光染料为sofia green，其可以稳定地染色牛奶中的体细胞，但所需的染色时间依旧过长（约为3 min）；此外，牛奶基质中的脂肪含量过高时（>5%），样品需要加水以1∶1（v∶v）的比例，甚至更大的倍数稀释，造成了操作过程的复杂性，增加了整体的检测时间。
7、此外，为了能够达到准确计数复杂基质中细胞的效果，通常需要冗长的分离方法（如：膜分离、梯度离心、色谱柱分离、电泳分离等）来除去干扰基质，随后对细胞进行染色计数分析，这极大地增加了染色的工作量及整体的操作时间。这种复杂且耗时的分离方法使得准确测量一些对时间敏感性较高的样品变得更为困难。例如，在牛奶中体细胞数的检测中，检测时长的增加，会造成牛奶样品质量的下降，从而造成体细胞的团聚。牛奶中的体细胞数量是反映牛奶安全和品质的重要指标，体细胞数量较高通常意味着乳腺发炎或其他乳房疾病的存在，这会导致牛奶品质下降，也可能导致患病奶牛淘汰从而影响产奶量和经济效益。因此，及时且有效的监测牛奶中的体细胞数量变化对于保证奶牛的健康状况以及牛奶品质至关重要。
8、对于上述问题，有必要开发一种染色效果好且快速的荧光染色复方及试剂盒，以实现对复杂体系中细胞快速且稳定的染色，以满足高效地对复杂基质中细胞计数的目的。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，旨在实现细胞快速且稳定的染色，以满足复杂基质中细胞精准计数的目的。
2、本发明首先提供了一种复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，配方按总体积100 ml计包括：
3、ph为6.0~8.0的缓冲体系；
4、荧光染料，所述荧光染料为sybr gold终浓度2×~40×或者碘化丙啶2~80mg；
5、曲拉通x-100（triton x-100）0.1~10 ml；
6、甘油0~24 ml；
7、edta-二钠0~800 mg。
8、荧光染料sybr gold购自北京兰博利德商贸有限公司，货号cg002-500 μl，500 μl/瓶，母液浓度为10000×，稀释10000倍为1×，稀释5000倍为2×，稀释250倍为40×。
9、优选的，所述复方染料还包括终浓度0~1 nm的聚酰胺-胺型树枝状高分子。聚酰胺-胺型树枝状高分子（pamam），目前该物质有第0代到第10代（g0-g10.0）产品，本技术中可以使用任意一代的产品，优选使用g4.0代产品。优选聚酰胺-胺型树枝状高分子终浓度1nm。
10、优选的，所述缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、tris- hcl缓冲体系或hepes缓冲体系；
11、和/或，所述缓冲体系中包含用于维持细胞渗透压的氯化钠。一般氯化钠浓度可以按生理盐水的浓度，即100 ml总体积中加入0.9 g氯化钠。
12、“和/或”表示可以选择“和”，也可以选择“或”，选择“和”时表示两者都需要满足，选择“或”时表示两者择一选择。
13、进一步优选的，所述缓冲体系为磷酸盐缓冲体系；ph为7.4；总体积100ml的复方染料中22.8 mg磷酸二氢钠、115 mg磷酸氢二钠、0.9 g氯化钠。
14、优选的，所述荧光染料为sybr gold 8×~16×或者碘化丙啶10~40 mg。
15、进一步优选的，所述荧光染料为sybr gold 12×或者碘化丙啶20 mg。
16、优选的，每100 ml总体积中，曲拉通x-100的体积为1~5 ml；甘油5~16 ml；edta-二钠200~600 mg。
17、进一步优选的，每100 ml总体积中，甘油10 ml；edta-二钠400 mg；
18、所述荧光染料为sybr gold时，曲拉通x-100的体积为5 ml；所述荧光染料为碘化丙啶时，曲拉通x-100的体积为1 ml。
19、为了使产品不容易变质，能够长时间保存，优选的，所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，还包括防腐剂。防腐剂可以使用现有常用的防腐剂种类和量，比如100 ml总体积中可以加入30 mg山梨酸钾。
20、本发明又提供了一种复杂基质中细胞荧光染色用的试剂盒，包括所述复方染料。
21、本发明还提供了一种细胞荧光染色方法，包括以下步骤：将所述复方染料与待测细胞样品混匀后，取样置于荧光显微镜下观察。一般所述复方染料与待测细胞样品可以按照体积比1∶1混合。混合时可以通过旋涡振荡器振荡混合，以便快速充分混合均匀。旋涡振荡器振荡混合时间10 s即可。
22、待测细胞样品优选为牛奶或者血液。牛奶或者血液样品中基质成分复杂，但本发明复方染料依然能够适用。
23、本发明复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料中各组分作用如下：
24、sybr gold或者碘化乙啶作为主染料成分，起主要作用。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠三者作为ph缓冲液，起到缓冲溶液并为维持细胞的渗透压的作用。曲拉通x-100作为表面活性剂，加强透膜率，加强染色的作用。甘油使染色细胞在观察时能够快速沉降，达到短时间内良好观察计数的目的。乙二胺四乙酸二钠盐（edta-二钠）用来降低细胞之间的团聚率，达到准确计数的目的。聚酰胺-胺型树枝状高分子（pamam）作为纳米级表面活性剂利用其表面电性达到细胞包裹的目的以加强细胞分散，同时使染色后的细胞核不散，再者在后续的微流体管道等流路中流动时，可起到表面防污的作用，加强管道的可重复使用率。山梨酸钾起到防腐的作用，使样品不易变质。
25、本发明有益效果：
26、（1）本发明优选的两种试剂盒复方荧光染料配方，均能实现在复杂基质中细胞的高效染色及其数量的准确计数，染料具有出色的荧光显色能力。
27、（2）该复方染料与其他染料相比，染色速率快（30 s内即可染色），且染色稳定，长时间光照，不易发生荧光猝灭。
1.一种复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，配方按总体积100ml计包括：
2.根据权利要求1所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，还包括终浓度0~1 nm的聚酰胺-胺型树枝状高分子。
3.根据权利要求1所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，所述缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、tris- hcl缓冲体系或hepes缓冲体系；
4.根据权利要求1所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，所述荧光染料为sybr gold 8×~16×或者碘化丙啶10~40 mg。
5.根据权利要求4所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，所述荧光染料为sybr gold 12×或者碘化丙啶20 mg。
6.根据权利要求1所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，每100 ml总体积中，曲拉通x-100的体积为1~5 ml；甘油5~16 ml；edta-二钠200~600 mg。
7.根据权利要求6所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，每100 ml总体积中，甘油10 ml；edta-二钠400 mg；
8.根据权利要求1所述复杂基质中细胞荧光染色用的复方染料，其特征在于，还包括防腐剂。
9.一种复杂基质中细胞荧光染色用的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~8任一所述复方染料。
10.一种细胞荧光染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
