本发明属于生物，具体涉及一种血橙外泌体的制备方法及其应用。
背景技术：
1、近年来，植物源细胞外囊泡引起了生物学界及医学界的极大关注，其具有与动物源外泌体相似的磷脂双分子层结构，携带丰富的蛋白质、脂质、核酸以及植物特有的次生代谢产物等。国内外已经开展了多类植物外泌体的提取及功效验证，植物外泌体已被证实具有良好的生物安全性和口服安全性，可以跨越生物学屏障。
2、目前，植物外泌体的提取工艺流程主要包含前处理流程及分离提取流程，前处理一般包含植物原料筛选清洗、破碎榨汁、低速离心等，获取富含植物外泌体的上清溶液；分离提取的方式主要有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法等，这两种方法是目前文献报道的植物外泌体分离纯化最常用方法，此外还有使用聚乙二醇沉淀法分离得到植物外泌体。动物细胞来源的外泌体的分离提取方式更为多样，除超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、沉淀法之外，还有免疫磁珠法、超滤离心法、尺寸排阻色谱法和微流控技术等，与动物源外泌体相比，在提取方法上植物外泌体相对比较单一，关于提取工艺优化的研究也较少，且和动物源外泌体不同的是，植物细胞具有天然的细胞壁成分，植物细胞壁主要由三部分组成，分别是胞间层、初生壁和次生壁，胞间层又被称为中胶层，其主要成分为果胶，构成相邻细胞中间层粘结物质，使植物组织细胞紧紧粘结在一起，并可缓冲细胞间的挤压。初生壁和次生壁的主要成分为纤维素，对植物细胞具有支持和保护作用。天然果胶类物质主要以原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，果胶具有一定的增稠特性，所有的植物中均包含一定量的果胶，柑橘类水果、苹果和杏之类的果胶含量最为丰富。
3、在对于植物外泌体的提取工艺研究上，目前主要聚焦于植物外泌体的分离纯化的研究上，对植物的前处理过程均为破碎榨汁，或压榨获取汁液，但是植物的种类丰富，该统一方法并不适用于所有植物类型，尤其对于血橙来说，直接进行破壁榨汁最后分离得到的样品中因含有果胶，会形成果冻状，影响后续外泌体的表征、功效检测以及应用，基于此，本发明针对这一类特殊植物的外泌体提取过程进行探究，针对果胶含量丰富的植物在前处理过程中加入酶解处理，并对酶解时间及温度均进行验证，摸索最大出汁率的酶解工艺，并且处理方法不影响外泌体的结构和功能，致力于通过前处理后提高此类植物外泌体的提取含量。现有技术中，也有对这类含有果胶或者纤维的植物外泌体的提取手段，但是直接使用这些方案，或者合理的调整，均无法较好的提取到血橙外泌体，因此，须对血橙外泌体单独研发一种外泌体的提取方法，既能去除果胶，又不影响外泌体的提取。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种适用于血橙外泌体的提取方法。
2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：
3、1）去离子水清洗血橙果肉表面，然后压榨、过滤，加入0.01-0.03g/l的果胶酶，充分溶解后置于35-40℃，酶解30-90min，即得酶解液；
4、2）将酶解液高速冷冻离心后收集上清液，然后经浓缩过滤后得浓缩液；
5、3）将浓缩液经超速离心后重悬，然后再次超速离心后重悬，即得血橙外泌体。
6、进一步的，所述压榨的具体方法为：取新鲜血橙，清洗干净后，剥皮；将剥皮后的血橙放置于压榨机中，缓慢匀速旋转上方手柄球，收集单次压榨出的血橙汁液，弃掉残渣。
7、进一步的，所述过滤使用的筛网为80-120目。
8、进一步的，所述高速冷冻离心的参数为：4℃，10000-16000g，离心40-60min。
9、进一步的，所述浓缩过滤具体为：收集上清液，经过切向流超滤系统浓缩过滤，所使用超滤膜截留分子量为100kda。
10、进一步的，所述超速离心的参数为：4℃，100000-150000g离心60-80min。
11、基于同一个发明构思，本发明还提供了上述方法制备得到的血橙外泌体。
12、基于同一个发明构思，本发明还提供了上述方法制备得到的血橙外泌体在制备化妆品中的应用。
13、本发明的有益效果为：
14、1）本发明采用单次压榨结合短时间酶解的方式可以避免人为因素对外泌体造成的破坏和获得到的非外泌体囊泡造成的污染，从而更好的收集到血橙外泌体。
15、2）本发明通过短时间酶解对血橙汁液进行前处理，针对常规酶解条件及方法进行改良，创新了一种不影响血橙外泌体结构及功能的酶解条件。本发明中采用的压榨及酶解的前处理工艺，可以极大提高血橙外泌体的提取效率及提取含量，得到的血橙外泌体纯度高及含量高。
1.一种血橙外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述压榨的具体方法为：取新鲜血橙，清洗干净后，剥皮；将剥皮后的血橙放置于压榨机中，缓慢匀速旋转上方手柄球，收集单次压榨出的血橙汁液，弃掉残渣。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述过滤使用的筛网为80-120目。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述高速冷冻离心的参数为：4℃，10000-16000g，离心40-60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述浓缩过滤具体为：收集上清液，经过切向流超滤系统浓缩过滤，所使用超滤膜截留分子量为100kda。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述超速离心的参数为：4℃，100000-150000g离心60-80min。
7.权利要求1至6任一项所述方法制备得到的血橙外泌体。
8.权利要求7所述的血橙外泌体在制备化妆品中的应用。
