本发明属于纳米抗体，涉及一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、pd-l1(程序性死亡配体1)是一种表达在肿瘤细胞表面的蛋白质，属于b7家族的一员。它是一种单一跨膜蛋白，包含一个细胞外胞浆区域、一个跨膜区域和一个细胞内胞浆区域。细胞外胞浆区域包含一个n-末端免疫球蛋白类区(igv)，用于与pd-1结合。细胞内胞浆区域含有多个位点，包括一个c-末端的pdz结合域，可与细胞内信号传导通路相互作用，参与免疫细胞的调控。研究发现当肿瘤细胞膜上的pd-l1与t细胞等免疫细胞上的pd-1结合后，肿瘤细胞发出抑制信号，导致t细胞不能识别肿瘤细胞，进而无法对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制，肿瘤细胞肆意生长。pd-l1在很多肿瘤中都表达，包括黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、皮肤鳞状细胞癌以及血液系统肿瘤在内的多种肿瘤。基于pd-l1在肿瘤中的重要性可以通过阻断pd-1/pd-l1信号重新激活肿瘤免疫微环境中的耗竭t细胞，恢复t细胞的活性，增强对肿瘤细胞的识别和杀伤力，从而发挥抗肿瘤作用，恢复机体的抗肿瘤免疫功能。然而，由于肿瘤的异质性及pd-l1表达的调节机制复杂性导致抗pd-l1单抗的临床应用受到很大限制，患者的总体客观缓解率在15％-30％左右。鉴于pd-l1在多个肿瘤类型中均有表达，且在正常组织中的表达有限，因此将抗pd-l1抗体与细胞毒素结合起做做成靶向pd-l1的adc，将是一个非常有前景的研发方向。然而目前上市的pd-l1抗体都是大分子抗体，大分子抗体对肿瘤的渗透性较差，所以需要小分子抗体如抗pd-l1纳米抗体去研发adc药物。
2、纳米抗体是1993年比利时的科学家发现的存在于驼科和鲨科中的天然缺失轻链的重链抗体的可变区，又叫单域抗体(singledomain antibody，sdab)，或vhh抗体。vhh晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kda，约为单克隆抗体分子量的1/10，故被称为纳米抗体(nanobody，nb)，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，与普通的四条链抗体和单链抗体相比，纳米抗体具有分子量小、溶解性高、稳定性高、易于表达、可以结合缝隙表位、免疫原性低等优点,因此，纳米抗体在新药开发领域具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，抗体分子量在14kda左右，能够与pd-l1特异性结合，可用于制备抗pd-l1的adc药物。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
3、本发明提供了一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seqid no:1所示。
4、本发明还提供了一种药物组合物，包含上述纳米抗体。
5、本发明还提供了上述纳米抗体的制备方法，包括：
6、1)将pd-l1蛋白对羊驼进行3次免疫，再收集羊驼外周血液，分离得到淋巴细胞；
7、2)提取所述淋巴细胞的总rna，反转录扩增cdna，再利用巢式pcr对cdna进行扩增，得到目的基因vhh；
8、3)将所述目的基因vhh与载体连接，并转化至感受态细胞，构建抗pd-l1纳米抗体基因文库；
9、4)将构建的抗pd-l1纳米抗体基因文库进行接种培养，再加入辅助噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到抗pd-l1纳米抗体展示文库；
10、5)对步骤4)得到的抗pd-l1纳米抗体展示文库进行筛选，得到阳性克隆，制得抗pd-l1蛋白的纳米抗体。
11、优选地，步骤2)中，所述巢式pcr共有两轮，
12、第一轮引物：
13、f1：ggtacgtgctgttgaactgttcc，
14、r1：cttggtggtcctggctgc；
15、第一轮pcr体系如下：
16、
17、反应条件为：98℃2min，98℃10s，48℃20s，72℃1min，25个循环；
18、第二轮引物：
19、f2：actgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc，
20、r2-1：ctcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg，r2-2：ctcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg；
21、第二轮pcr体系如下：
22、
23、反应条件为：98℃2min，98℃10s，60℃20s，72℃1min，30个循环。
24、优选地，步骤3)中，载体为pcomb3xss质粒，感受态细胞为tg1大肠杆菌。
25、优选地，步骤4)又包括：取步骤3)构建的抗pd-l1纳米抗体基因文库加入到lb培养基中，37℃培养2.5h后加入辅助噬菌体，30℃，220rpm过夜培养；第二天10000g，离心10min，取上清，加入peg-nacl溶液，4℃放置8h后离心，用pbs重悬沉淀，得到抗pd-l1纳米抗体展示文库。
26、优选地，步骤5)又包括：
27、①将生物素化的pd-l1蛋白和步骤4)得到的抗pd-l1纳米抗体展示文库加入到ep管中，37℃孵育1h后加入含有链霉素的磁珠再次孵育30min；
28、②将ep管放到磁力架上，去除管中溶液后从磁力架上拿下来后再加入pbst溶液用移液枪吹匀磁珠，重复该步骤，共用pbst洗3遍；
29、③pbst洗3遍后将磁珠加入到tg1大肠杆菌中，37℃，培养2.5h后取部分菌液涂氨苄抗性的平板测第一轮的洗脱滴度，其余的菌液加入lb培养基和辅助噬菌体，30℃，220rpm过夜培养；
30、④第二天离心，取上清，加入peg-nacl溶液，4℃放置8h后离心，用pbs重悬沉淀，得到抗pd-l1纳米抗体第一轮筛选展示文库，重复进行三轮筛选；
31、⑤从测第三轮筛选洗脱滴度的平板上挑取单克隆加入到lb培养基中，37℃，培养2.5h后加入辅助噬菌体，30℃，220rpm过夜培养，第二天离心，取上清，经elisa亲和检测，筛选到抗pd-l1蛋白的纳米抗体。
32、本发明还提供了上述纳米抗体在制备抗pd-l1的adc药物中的应用。
33、本发明中制备出了一个抗pd-l1的纳米抗体，可以特异性的高亲和力的结合pd-l1，又因为纳米抗体的分子量小，可以更好的被摄取进细胞，因此可以制备抗pd-l1的adc药物，进一步扩大了抗体的应用潜力。
1.一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.一种药物组合物，包含权利要求1所述的纳米抗体。
3.权利要求1所述的纳米抗体的制备方法，包括：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述巢式pcr共有两轮，
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)又包括：取步骤3)构建的抗pd-l1纳米抗体基因文库加入到lb培养基中，37℃培养2.5h后加入辅助噬菌体，30℃，220rpm过夜培养；第二天10000g，离心10min，取上清，加入peg-nacl溶液，4℃放置8h后离心，用pbs重悬沉淀，得到抗pd-l1纳米抗体展示文库。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，载体为pcomb3xss质粒，感受态细胞为tg1大肠杆菌。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5)又包括：
8.权利要求1所述的纳米抗体在制备抗pd-l1的adc药物中的应用。
