本发明属于生物发酵，具体涉及一种通过控制温湿度提高生物素发酵产量及稳定性的方法。
背景技术：
1、生物素，是b族维生素的一种，是自然界普遍存在的一种水溶性维生素，又称维生素h、维生素b7或者辅酶r。它在动物的肝、肾、脾等器官，蛋黄及酵母菌中含量丰富。生物素的化学名为(3as,4s,6ar)-六氢-2-氧代-1h噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊酸，其结构中含有一个咪唑环、一个四氢噻吩环和一个正戊酸侧链，其结构决定了它有多种同分异构体，只有d-生物素具有生物活性。生物素不仅是羧化酶的辅酶，也是蛋白质、糖和脂肪中间代谢的辅酶，生物素还与多种营养物质如糖、维生素b6、维生素b12、维生素c、泛酸、叶酸等等的代谢息息相关。生物素在医药、食品和化妆品、生物技术、饲料添加剂等方面均有广泛应用。
2、生物素的结构复杂，实现工业化生产的技术难度大。工业上通常采用化学合成的方法获得生物素，如scheme工艺路线。sternbach路线是到目前为止工业化生产的基础，现行的工业化生产路线均是在此基础上加以改进的。但是化学合成存在线路复杂、毒性大、收率低、危险性大等难以克服的缺点。生物素也可以通过提取法获得。提取法可以从动物组织、南极磷虾、玉米浆、甜菜糖蜜、槟榔嫩果等多种物质中获得生物素。但是提取法成本高、产量小，难以实现工业化。
3、发酵法是比较理想的获取生物素的方法。反应条件温和、原材料无毒或者低毒，反应过程可控或者可调节。但是发酵法目前的效价比较低，相比化工合成，目前在成本上不占优势。所以要想发酵法生产生物素实现工业化，需不断优化生物素的发酵工艺。浙江圣达生物药业股份有限公司通过不断优化发酵工艺，效价较原始工艺产量提高了21％-170％，周期缩短了13％-28％。浙江大学通过基因工程得到的菌株具有高效合成生物素的能力，在以庚二酸为底物的培养基中进行补料发酵时生物素产量可以达到417mg/l，是原始大肠杆菌的200倍，产率达到10.4mg/(l·h)。这些工艺优化使工业化发酵合成生物素实现迈进一大步。
4、对发酵影响比较显著的工艺条件包括温度和溶氧。实验室控制溶氧一般通过调整转速，生产除了可以调整转速还可以结合空气流量联合控制。培养温度除了影响菌体生长的速度，还会影响菌体内多种酶的活力，进而影响菌体生产能力。但是湿度对发酵的影响目前没有具体的研究。
技术实现思路
1、本发明的目的在于目前生物素的发酵法制备的现状，提出一种通过控制温湿度提高生物素发酵产量及稳定性的方法。空气湿度可以通过影响培养基的水分蒸发量，进一步影响培养基中的营养物质浓度、培养基的渗透压以及培养基的水活度，影响环境的杂菌聚集情况，从而进一步综合影响菌种生长情况和生产能力。本发明的方法能够有效提高发酵法生产生物素的效价。
2、为实现以上目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种通过控制温湿度提高生物素发酵产量及稳定性的方法，包括如下步骤：
4、(1)将能合成生物素的菌种接入固体培养基，在温度为34-38℃，湿度为10-60％范围内，保持恒温恒湿培养至菌落大小或者菌苔厚度合格；
5、(2)将菌落直接转接至发酵培养基发酵培养；或者先转接液体培养基再转接发酵培养基补料发酵培养，发酵温度为28-38℃，湿度与步骤(1)相同，最终获得生物素。
6、优选的，所述能合成生物素的菌种优选为基因工程大肠杆菌。
7、优选的，所述固体培养基的组成用量为：5-15g/l的胰蛋白胨，1-10g/l的酵母浸粉，1-10g/l的氯化钠，0.5-2g/l的葡萄糖，0.5-2g/l的牛肉膏。
8、优选的，所述液体培养基的组成用量为：5-15g/l的复合碳源，5-15g/l的复合氮源，10-20g/l的无机盐，1-5ml/l的微量元素混合液。
9、优选的，发酵培养基的用量为：15-30g/l的复合碳源，10-20g/l的复合氮源，10-20g/l的无机盐，1-10ml/l的微量元素混合液，0.5-2ml/l的消泡剂。
10、更优选的，所述复合碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的至少一种；所述复合氮源为蛋白胨、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、玉米浆干粉、尿素中的至少一种；所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、谷氨酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、碳酸钙、氯化钙中的至少一种；所述微量元素混合液的组分用量为：0.1-5g/l的硫酸锌、0.1-3g/l的硫酸锰、0.1-10g/l的硫酸亚铁、0.1-2g/l的氯化钴、0.1-1g/l的甜菜碱、0.1-2g/l的氯化胆碱、0.1-1g/l的烟酸、0.1-1g/l的叶酸和0.1-1g/l的硫胺素。
11、优选的，所述步骤(2)将菌落直接转接至发酵培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度28-38℃培养40-48h；将菌落先转接液体培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度34-38℃培养4-8h，后转接发酵培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度28-38℃培养40-48h。
12、优选的，所述补料为葡萄糖、mops以及氨水中的至少一种。
13、本发明的有益效果为：
14、本发明通过严格控制生物素发酵过程的温度和湿度，能够将生物素发酵效价波动由原来的30％下降至10％，效价整体提升20％。
1.一种通过控制温湿度提高生物素发酵产量及稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能合成生物素的菌种优选为基因工程大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基的组成用量为：5-15g/l的胰蛋白胨，1-10g/l的酵母浸粉，1-10g/l的氯化钠，0.5-2g/l的葡萄糖，0.5-2g/l的牛肉膏。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基的组成用量为：5-15g/l的复合碳源，5-15g/l的复合氮源，10-20g/l的无机盐，1-5ml/l的微量元素混合液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基的用量为：15-30g/l的复合碳源，10-20g/l的复合氮源，10-20g/l的无机盐，1-10ml/l的微量元素混合液，0.5-2ml/l的消泡剂。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述复合碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的至少一种；所述复合氮源为蛋白胨、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、玉米浆干粉、尿素中的至少一种；所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、谷氨酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、碳酸钙、氯化钙中的至少一种；所述微量元素混合液的组分用量为：0.1-5g/l的硫酸锌、0.1-3g/l的硫酸锰、0.1-10g/l的硫酸亚铁、0.1-2g/l的氯化钴、0.1-1g/l的甜菜碱、0.1-2g/l的氯化胆碱、0.1-1g/l的烟酸、0.1-1g/l的叶酸和0.1-1g/l的硫胺素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将菌落直接转接至发酵培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度28-38℃培养40-48h；将菌落先转接液体培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度34-38℃培养4-8h，后转接发酵培养基培养的装液量(20-50)ml/250ml，转速220-280rpm，温度28-38℃培养40-48h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料为葡萄糖、mops以及氨水中的至少一种。
