本发明涉及一种亚胺还原酶突变体及其应用，属于生物酶催化。
背景技术：
1、烟碱(1-甲基-2-[3-吡啶基]吡咯烷)又名尼古丁，是一种存在于烟草植物叶子中的天然物质，被广泛应用于烟草、农业以及医药等领域，其中，6-甲基烟碱[(s)-2-甲基-5-(1-甲基吡咯烷-2-基)]吡啶是一种重要的衍生物，可以作为药物，辅助药物，农药和杀虫剂等。市场上以烟碱为有效成分的药物销售额在逐年增长，国内生产的6-甲基烟碱大多纯度较低；因此，制备高纯度6-甲基烟碱具有巨大应用价值。
2、目前，6-甲基烟碱的合成主要由两种方法，一种是化学合成法，但此法步骤繁杂，成本过高，后续分离提取耗费大且对环境危害较大。另一种是生物催化法，先合成6-甲基烟碱的前体6-甲基降烟碱，之后再合成烟碱，此法具有高度的立体选择性，且具备反应条件温和、对环境友好等优点，因此有良好的工业应用前景和经济效益。
3、然而，6-甲基烟碱的酶法合成效率由于受到酶活的限制，仍需要进一步进行提升。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明提供一种亚胺还原酶突变体及其应用，目的在于以一种nadph依赖型的亚胺还原酶突变体催化6-甲基麦斯明合成6-甲基降烟碱，并对反应条件进行优化以期高效还原6-甲基麦斯明为6-甲基降烟碱。
2、本发明提供的第一个技术方案为一种亚胺还原酶突变体，所述突变体是对亚胺还原酶亲本的第122位丙氨酸、第171位缬氨酸、第174位酪氨酸、第175位苯丙氨酸、第213位天冬氨酸、第236位色氨酸、第241位丝氨酸、第242位精氨酸、第244位丙氨酸和/或第283位缬氨酸进行突变获得，所述亲本的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、在某些实施方式中，所述突变体是对所述亲本进行如下任一种突变：
4、(1)将第122位丙氨酸a突变为丝氨酸s；
5、(2)将第171位缬氨酸v突变为甘氨酸g；
6、(3)将第174位酪氨酸y突变为甲硫氨酸m；
7、(4)将第175位苯丙氨酸f突变为精氨酸r；
8、(5)将第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m；
9、(6)将第236位色氨酸w突变为精氨酸r；
10、(7)将第241位丝氨酸s突变为精氨酸r；
11、(8)将第242位精氨酸r突变为甲硫氨酸m；
12、(9)将第244位丙氨酸a突变为精氨酸r；
13、(10)将第283位缬氨酸v突变为精氨酸r；
14、(11)将第122位丙氨酸a突变为丝氨酸s，第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m；
15、(12)将第171位缬氨酸v突变为甘氨酸g，第175位苯丙氨酸f突变为精氨酸r；
16、(13)将第174位酪氨酸y突变为甲硫氨酸m，第242位精氨酸r突变为甲硫氨酸m；
17、(14)将第236位色氨酸w突变为精氨酸r，第283位缬氨酸v突变为精氨酸r。
18、(15)将第171位缬氨酸v突变为甘氨酸g，第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m，第283位缬氨酸v突变为精氨酸r。
19、(16)将第175位苯丙氨酸f突变为精氨酸r，将第242位精氨酸r突变为甲硫氨酸m，将第244位丙氨酸a突变为精氨酸r。
20、(17)将第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m，将第241位丝氨酸s突变为精氨酸r，将第283位缬氨酸v突变为精氨酸r。
21、(18)将第171位缬氨酸v突变为甘氨酸g，将第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m，将第241位丝氨酸s突变为精氨酸r，将第244位丙氨酸a突变为精氨酸r。
22、(19)将第174位酪氨酸y突变为甲硫氨酸m，将第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m，将第244位丙氨酸a突变为精氨酸r，将第283位缬氨酸v突变为精氨酸r。
23、本发明提供的第二个技术方案为编码第一个技术方案所述突变体的基因。
24、本发明提供的第三个技术方案为携带第二个技术方案所述基因的重组载体。
25、在某些实施方式中，以pet-30a(+)为表达载体。
26、本发明提供的第四个技术方案为表达有第一个技术方案所述突变体，或者含有第二个技术方案所述基因，或者转化有第三个技术方案所述重组载体的重组微生物细胞。
27、在某些实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于细菌或真菌。
28、在某些实施方式中，所述微生物为大肠杆菌。
29、在某些实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌bl21(de3)为宿主细胞。
30、本发明提供的第五个技术方案为一种提高亚胺还原酶酶活的方法，所述方法为将氨基酸序列如seq id no.2所示的亚胺还原酶亲本进行如(a)～(j)任一项所示的单点突变或组合突变：
31、(a)将第122位丙氨酸a突变为丝氨酸s；
32、(b)将第171位缬氨酸v突变为甘氨酸g；
33、(c)将第174位酪氨酸y突变为甲硫氨酸m；
34、(d)将第175位苯丙氨酸f突变为精氨酸r；
35、(e)将第213位天冬氨酸d突变为甲硫氨酸m；
36、(f)将第236位色氨酸w突变为精氨酸r；
37、(g)将第241位丝氨酸s突变为精氨酸r；
38、(h)将第242位精氨酸r突变为甲硫氨酸m；
39、(i)将第244位丙氨酸a突变为精氨酸r；
40、(j)将第283位缬氨酸v突变为精氨酸r。
41、本发明提供的第六个技术方案为一种制备6-甲基降烟碱的方法，所述方法为以6-甲基麦斯明作为底物，利用第一个技术方案所述突变体作为催化剂组成催化体系，催化生成6-甲基降烟碱。
42、在某些实施方式中，在催化体系中，所述催化剂的浓度为3g/l。
43、进一步，所述催化剂的制备方法如下：将重组微生物细胞接种至发酵培养基中，当od600在0.5-0.7时加入iptg进行诱导表达所述催化剂。
44、进一步，所述发酵培养基含有：酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甘油。
45、进一步，诱导温度为25℃。
46、进一步，诱导时间为17小时。
47、进一步，iptg添加的终浓度为0.1-0.5mm。
48、进一步，是重组微生物细胞为以大肠杆菌bl21(de3)为宿主菌，以pet-30a(+)为表达载体，表达所述亚胺还原酶突变体。
49、在某些实施方式中，所述催化反应温度为28℃，反应ph为6～10。
50、在某些实施方式中，所述催化体系中还包括辅因子，所述辅因子为nadp+。
51、在某些实施方式中，所述6-甲基麦斯明作为底物，以滴加的方式添加入反应体系中，终浓度为20g/l，200rpm，反应6-12h。
52、在某些实施方式中，催化结束后经离心、碱化、萃取得到6-甲基降烟碱。
53、在某些实施方式中，所述碱化即6-甲基麦斯明与亚胺还原酶反应结束后用无机碱调节ph值，所述无机碱为氢氧化钠。
54、在某些实施方式中，所述萃取即用有机溶剂合并有机相，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
55、本发明提供的第七个技术方案为第一个技术方案所述的突变体，或者第二个技术方案所述的基因，或者第三个技术方案所述的重组载体，或者第四个技术方案所述的重组微生物细胞，或者第五个技术方案所述的方法，或者第六个技术方案所述的方法在生产6-甲基降烟碱或含6-甲基降烟碱产品中的应用。
56、本发明的技术效果如下：
57、本发明所涉及的亚胺还原酶突变体，经过其催化使底物6-甲基麦斯明在6h内能够被还原成6-甲基降烟碱的转化率可以达到99.8％，产物光学纯度ee值达到99.5％。本发明涉及到的亚胺还原酶突变体能够对麦斯明进行还原生成6-甲基降烟碱，该过程完全依赖于亚胺还原酶，且在较短时间内高效完成还原，具有以下优点：反应时间短，操作安全，绿色环保，原料利用率高等。
1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是对亚胺还原酶亲本的第122位丙氨酸、第171位缬氨酸、第174位酪氨酸、第175位苯丙氨酸、第213位天冬氨酸、第236位色氨酸、第241位丝氨酸、第242位精氨酸、第244位丙氨酸和/或第283位缬氨酸进行突变获得，所述亲本的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是对所述亲本进行如下任一种突变：
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pet-30a(+)为表达载体。
6.表达有权利要求1或2所述突变体，或者含有权利要求3所述基因，或者转化有权利要求4或5所述重组载体的重组微生物细胞。
7.根据权利要求6所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞以大肠杆菌bl21(de3)为宿主细胞。
8.一种提高亚胺还原酶酶活的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如seq idno.2所示的亚胺还原酶亲本进行如（a）~（j）任一项所示的单点突变或组合突变：
9.一种制备6-甲基降烟碱的方法，其特征在于，所述方法为以6-甲基麦斯明作为底物，利用第一个技术方案所述突变体作为催化剂组成催化体系，催化生成6-甲基降烟碱。
10.权利要求1或2所述的突变体，或者权利要求3所述的基因，或者权利要求4或5所述的重组载体，或者权利要求6或7所述的重组微生物细胞，或者权利要求8所述的方法，或者权利要求9所述的方法在生产6-甲基降烟碱或含6-甲基降烟碱产品中的应用。
