本发明属于基因生物,具体涉及鉴定小麦抗茎基腐病基因的snp位点及其应用。
背景技术:
1、小麦茎基腐病(fusarium crown rot,fcr)是由多种镰孢菌( fusarium spp.)引起的一种典型土传病害,广泛分布于全球各地,并呈不断蔓延和加重趋势。在我国,小麦茎基腐病主要由假禾谷镰刀菌( fusarium pseudograminearum)引起。小麦幼苗被镰刀菌侵染后,茎基部叶鞘和茎秆变褐,严重时引起幼苗发黄、枯萎;灌浆期发病可导致穗部干枯。茎基腐病的发生不但给小麦造成严重的产量和经济损失,在病害发展过程中还会产生don等生物毒素和次级代谢物,对食品和饲料产品也具有严重的负面影响。
2、茎基腐病是近年来包括我国在内世界上主要小麦生产国最重要的病害之一。由于近年来天气变化,干旱频发,茎基腐病发生态势严峻,侵染范围广,危害程度大,已经引起全世界小麦研究者的重点关注。然而,目前针对小麦茎基腐病的研究主要集中在病原菌的收集、不同小麦品种的抗性鉴定以及抗病基因的初步定位。小麦茎基腐病抗病基因的发掘和利用及抗病基因参与的调控途径等研究还处在起步阶段。
3、近年来,国内外学者从抗病基因发掘和种质资源鉴定等方面开展了一系列研究。但是,已发掘的主效抗病基因少且分子标记缺乏、可用于育种的抗源匮乏仍是当前抗病育种工作面临的主要问题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是如何快速准确地鉴定小麦抗茎基腐病基因。
2、为了解决上述问题,本发明首先提供了检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的物质的应用,所述snp位点为小麦基因组中的一个位点,其核苷酸种类为a或g,为序列表中序列1的第51位核苷酸;所述应用为下述任一种:
3、a1)所述物质在鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病抗性的应用,
4、a2)所述物质在小麦育种中的应用,
5、a3)所述物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病抗性的产品中的应用,
6、a4)所述物质在制备小麦育种的产品中的应用。
7、上述物质为如下b1)、b2)或b3):
8、b1)所述物质为扩增包括所述snp位点在内的小麦基因组dna片段的引物组合物,
9、b2)所述物质为含有b1)所述引物组合物的pcr试剂,
10、b3)所述物质为含有b1)所述引物组合物或b2)所述pcr试剂的试剂盒。
11、上述应用中,所述引物组合物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料;放射性标记,诸如32p;结合部分,诸如生物素(biotin);半抗原,诸如地高辛(dig);发光、发磷光或发荧光部分;和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地,可以是电荷中性的。标记可以包括核酸序列或蛋白序列或由其组合,只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中,核酸在没有标记的情况下直接检测(例如,直接读取序列)。
12、上述引物组合物可由引物a、引物b和/或引物c组成;
13、所述引物a为核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-41位的单链dna,
14、所述引物b为核苷酸序列是序列表中序列3的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-41位的单链dna,
15、所述引物c是核苷酸序列是序列表中序列4的单链dna分子。
16、本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状的方法,所述方法包括检测待测小麦基因组中snp位点的基因型,根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状,所述snp位点为上述snp位点。
17、上述方法中,所述snp位点的基因型为aa、ag或gg,所述aa是所述snp位点为a的纯合型,所述gg是所述snp位点为g的纯合型,所述ag是所述snp位点为a和g的杂合型。
18、上述方法中,所述小麦可为自交系或纯系。
19、上述方法中,根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状可为所述基因型为aa的待测小麦抗茎基腐病性状高于所述基因型为gg的待测小麦。
20、上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。
21、本发明还提供了一种小麦育种的方法,所述方法包括检测小麦基因组中上述snp位点的基因型,选择所述snp位点的基因型为aa的小麦作为亲本进行小麦抗茎基腐病育种;该位点也可用于小麦茎基腐病抗性水平筛选,所述aa是所述snp位点为a的纯合型。所述育种的育种目标包括小麦抗茎基腐病。所述育种的目的包括培育小麦抗茎基腐病性状优秀(抗茎基腐病性状高于亲本)的小麦。
22、作为一种实施方法,小麦育种的方法可包括如下步骤:
23、(1)以待测小麦的基因组dna为模板,采用上述引物组进行kasp;
24、(2)完成步骤(1)后,进行荧光检测,确定待测小麦所述snp位点的基因型;
25、(3)选择aa基因型小麦进行育种。
26、本发明还提供了用于检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的产品,所述snp位点为上述snp位点,所述产品含有上述物质,所述产品为下述任一种:
27、c1)检测或辅助检测小麦抗茎基腐病性状相关的单核苷酸多态性或基因型的产品,
28、c2)鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状的产品,
29、c3)用于小麦育种的产品,
30、c4)筛选或选育抗茎基腐病的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
31、可选地,所述产品可为如下任一种:
32、d1)所述产品为扩增包括所述snp位点在内的小麦基因组dna片段的引物组合物,
33、d2)所述产品为含有d1)所述引物组合物的pcr试剂,
34、d3)所述产品为含有d1)所述引物组合物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
35、上述引物组合物可由引物a、引物b和/或引物c组成;
36、所述引物a为核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-41位的单链dna,
37、所述引物b为核苷酸序列是序列表中序列3的单链dna分子或核苷酸序列是序列表中序列3的第22-41位的单链dna,
38、所述引物c是核苷酸序列是序列表中序列4的单链dna分子。
39、本发明还提供了dna分子,所述dna分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。
40、所述序列1的具体序列为:5`-gttagttgagtctgtaatagggcggctcctgctatcatgcgatcggcgga[ag]catgtcgtcgtaggtgcttggtatgttgaagctccggatttcatccgagc-3`。
41、上述dna分子的应用也在本发明的保护范围之内,所述应用为如下任一种:
42、e1)所述dna分子在鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状的应用,
43、e2)所述dna分子在小麦育种中的应用,
44、e3)所述dna分子在制备鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状的产品中的应用,
45、e4)所述dna分子在制备小麦育种的产品中的应用,
46、e5)所述dna分子在筛选或选育抗茎基腐病性状优秀的小麦单株或株系或品系或品种的产品中的应用,
47、e6)所述dna分子在辅助筛选或辅助选育抗茎基腐病性状优秀的小麦单株或株系或品系或品种的产品中的应用。
48、所述产品可为试剂盒。
49、所述试剂盒包含扩增包括所述snp位点在内的小麦基因组dna片段的引物组合物。
50、用上述引物组合物进行pcr扩增,反应可按照如下体系进行:扩增反应总体积4 µl,0.048 μl primer mix,2.0 μl master mix,1.952μl template dna(50 ng/μl),mastermix购买自lgc公司,primer mix的配比为:12%hex引物、12%fam引物、30%的common引物,引物由上海生工公司合成。扩增使用384孔pcr仪(bio-rad, s1000tmthermal cycler),程序如下:94℃ 15 min;94℃ 20s、6355℃ 1 min(每个循环降1℃),10个循环;94℃ 20s、55℃60s,32个循环。pcr扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪(pherastarplus snp, bmglabtech)中读取最终荧光数据,然后将数据导入klustercaller v3.4软件(lgc,hoddesdon, uk)进行基因分型。
51、上述检测扩增产物方法为对扩增产物放在自动聚焦荧光多功能酶标仪(pherastarplus snp, bmg labtech)中读取最终荧光数据,然后将数据导入klustercaller v3.4软件(lgc, hoddesdon, uk)进行基因分型。
52、本发明可用于快速准确鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状,可以对小麦材料进行早期筛选,可用于小麦分子标记辅助育种。将本发明中的物质运用于小麦抗茎基腐病性状分子标记辅助选择,能快速筛选出小麦抗茎基腐病性状优秀的小麦品种(种质),从而加速培育小麦抗病新品种的进程,在发掘小麦种质资源和选育具有较高抗茎基腐病性状的小麦品种的研究中具有重要的理论意义和经济价值。
1.检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的物质的应用,其特征在于:所述snp位点为小麦基因组中的一个位点,其核苷酸种类为a或g,为序列表中序列1的第51位核苷酸;所述应用为下述任一种:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述物质为如下b1)、b2)或b3):
3.鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状的方法,其特征在于:所述方法包括检测待测小麦基因组中snp位点的基因型,根据所述基因型鉴定或辅助鉴定小麦抗茎基腐病性状,所述snp位点为权利要求1中所述snp位点。
4.权利要求3所述的方法在小麦育种中的应用。
5.小麦育种的方法,其特征在于:所述方法包括检测小麦基因组中权利要求1中所述snp位点的基因型,选择所述snp位点的基因型为aa的小麦作为亲本进行育种,所述aa是所述snp位点为a的纯合型。
6.用于检测小麦基因组中snp位点的多态性或基因型的产品,其特征在于:所述snp位点为权利要求1中所述snp位点,所述产品含有权利要求1中所述物质,所述产品为下述任一种:
7.根据权利要求6所述的产品,其特征在于:所述产品为如下d1)、d2)或d3):
8.根据权利要求2所述的应用或权利要求7所述的产品,其特征在于:所述引物组合物由引物a、引物b和/或引物c组成;
9. dna分子,其特征在于:所述dna分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。
10.权利要求9所述的dna分子的应用,所述应用为下述任一种: