本发明属于微生物快速检测领域，尤其涉及食品中副溶血弧菌的快速检测。
背景技术：
1、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种主要的海洋致病菌，是全世界海产品细菌性食物中毒的主要病原菌。副溶血性弧菌隶属于壶菌科弧菌属，为革兰氏阴性嗜盐性海洋细菌，副溶血性弧菌主要存在于浅海地区，并且在几乎所有水生生物中可大量生长繁殖。临床上可引起人类腹痛、呕吐及腹泻等症状，甚至会导致死亡。世界第一例有记录的副溶血性弧菌食物中毒发生在日本，1950年日本大阪发生一起食用青鱼干引起的爆发性食物中毒事件，造成272人发病、20人死亡，日本人藤野从青鱼干中最早分离得到的副溶血性弧菌。1963年由日本人sakazaki等正式命名。据我国食源性疾病监测网资料统计，副溶血性弧菌已成为我国食物中毒首位病原菌，在沿海地区副溶血性弧菌引起的食物中毒占比高达50％～70％。2016年国家食品安全风险评估中心发布《不可忽视的食源性致病菌——副溶血性弧菌》，指出近年来副溶血性弧菌已经跃居我国食源性疾病微生物致病因子榜首。
2、目前，我国已经制定了相关的检验标准，如国家标准gb4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》等，但是，该检验方法主要检测流程包括预增菌、选择性增菌、目标菌株分离培养、血清学生化鉴定等步骤，耗时较长，阳性样品需要一周的时间才能确定实验结果，无法满足食品安全快速检测需求。
3、2022年，李达容(李达容.水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌raa-lfd快速检测方法的建立与应用研究.硕士,2022.)基于多重重组酶介导等温扩增技术与侧流层析试纸条(raa-lfd)针对副溶血性弧菌的tox r基因建立快检方法，36℃～38℃下，20min可以完成快速检测，不经富集，raa-lfd法对养殖水、虾、蛤蜊和鱼中副溶血性弧菌的灵敏度分别为7.4×103cfu/ml、7.4×104cfu/g、7.4×104cfu/g和7.4×105cfu/g。富集4h后低污染量(7.4cfu/g)的副溶血性弧菌可被检测到。在实际样品检测中，raa-lfd法与国标法gb4789.72013和pcr法的检测结果均表现出良好的符合率，分别达90.6％和94.1％，结果具有较高一致性(k>0.75)。
4、2020年，厉佳丽等人(厉佳丽.食源性致病菌多重重组酶聚合酶扩增快速检测技术研究.硕士,2020.)以金黄色葡萄球菌nuc基因(genbank登录号:ef529607.1)、副溶血性弧菌toxr基因(genbank登录号:gq228073.1)、沙门氏菌fimy基因(genbank登录号:jq665438.1)为检测靶标，基于rpa-lfd技术建立针对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及沙门氏菌的快检技术，最佳反应温度为37℃，最适反应时间为10min(不包括lfd的检测时间)。多重lfd-rpa方法检测灵敏度高，金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌检测限分别为2.6×101cfu/ml、7.6×101cfu/ml、1.3×101cfu/ml。人工污染样品检测实验中，多重lfd-rpa方法检测人工污染食物样品中的金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的检出限分别为4.5×101cfu/ml、8.3×101cfu/ml和2.7×101cfu/ml。
5、2020年，刘小青等人(刘小青等,rpa等温扩增技术检测副溶血性弧菌食品工业科技2020,41(01),112-118)基于重组聚合酶—荧光探针(rpa-exo)法，针对副溶血性弧菌建立快检方法，15min可获得结果，具有高特异性，无交叉反应；灵敏度为1.0×103cfu/ml，dna检测限为0.35pg/μl，模拟污染实验中加入终浓度为1.36×103cfu/ml时，无需增菌即可被检出；实际样品检测中，10份水产品，有3份样品被检出，检测结果与国标gb4789.7-2013结果一致。
6、2024年，xu等人(xu,y.等，3d-printed integrated handheld biosensor forthe detection of vibrio parahaemolyticus.foods 2024,13(11).)基于rpa-lfd技术开发了副溶血性弧菌的检测技术，同时研发了手持结果判读设备对结果进行判定。应用该技术检测的灵敏度可以达到4.9cfu/ml。
7、2022年，jin等(jin,b.等,simultaneous detection of five foodbornepathogens using a mini automatic nucleic acid extractor combined withrecombinase polymerase amplification and lateral flowimmunoassay.microorganisms 2022,10(7).)人基于rpa-lfd技术建立了一种可以同时检测副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌o157:h7和单核细胞增生李斯特菌的多重rpa扩增技术。这种技术37℃下15分钟可以完成扩增反应。优化后的rpa-lfia检测限可达到101cfu/ml。在加标食品样本中的平均回收率为90.5-104.5％。
8、2021年，wu(wu,h.等,areversible valve-assisted chip coupling withintegrated sample treatment and crispr/cas12a for visual detection of vibrioparahaemolyticus.biosens bioelectron 2021,188,113352.)等人基于rpa-荧光侧流向试纸条技术开打了一种可以对单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌o157:h7同时检测的多重rpa快检技术。整个实验过程可以在37℃下20分钟内完成。基于eunp的lfia-rpa检测限分别为单核细胞增生李斯特菌9.0个菌落形成单位(cfu)/ml，副溶血性弧菌7.0cfu/ml，大肠杆菌o157:h7 4.0cfu/ml。
9、2020年，yang等人(yang,x.等,an improved recombinase polymeraseamplification assay for visual detection of vibrio parahaemolyticus withlateral flow strips.j food sci 2020,85(6),1834-1844.)建立了一项基于rpa-lfs的可以对副溶血性弧菌进行快检的技术，在35至45℃下进行，只需25分钟即可完成检测反应。富集2h后，灵敏度可以达到10cfu/10g食品。
10、2020年ma等人(ma,b.等,multiplex recombinase polymerase amplificationassay for the simultaneous detection of three foodborne pathogens inseafood.foods 2020,9(3).)基于rpa-lfs技术建立了一种可以同时完成对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的多重rpa检测，整个过程，包括扩增和读数，可以在37℃下15分钟内完成。检测限分别为金黄色葡萄球菌26cfu/ml，副溶血性弧菌76cfu/ml，肠炎沙门氏菌12.9cfu/ml。该方法在对加标食品样本的测试中显示出良好的恢复率(92.00％-107.95％)。
11、2020年，jiang等人(jiang,w.等,recombinase polymerase amplification-lateral flow(rpa-lf)assay combined with immunomagnetic separation for rapidvisual detection of vibrio parahaemolyticus in raw oysters.anal bioanal chem2020,412(12),2903-2914.)首次尝试优化一种结合免疫磁性分离(ims)的重组酶聚合酶扩增(rpa)和侧流(lf)检测方法，用于检测生蚝中的副溶血性弧菌。rpa-lf检测能在15分钟内完成v.parahaemolyticus的检测，包括在37℃下进行10分钟的rpadna扩增，并通过lf条带可视化扩增子5分钟。对于加入的牡蛎样本，通过ims-rpa-lf富集4小时后，v.parahaemolyticus的检测灵敏度提高到2cfu/g。
12、2019年，geng等人(geng,y.等,development and evaluation of arapid andsensitive rpaassay for specific detection of vibrio parahaemolyticus inseafood.bmc microbiol 2019,19(1),186.)利用realtime rpa技术建立针对副溶血性弧菌的快检方法，在38℃下，20min即可以完成检测反应，对于标准菌株，检测限为102copy/反应，对于人工污染样本，在不同细菌浓度下，经过6小时富集后，检出限可以在酱油、鳕鱼和带鱼中分别低至4cfu/25克、1cfu/25克和7cfu/25克的浓度下，通过实时rpa在5-12分钟内检测到副溶血性弧菌。
13、此外，还有一些专利技术进行了副溶血弧菌的rpa检测。如cn106967816a中公开一种检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物及试剂盒与应用，根据副溶血弧菌toxr基因设计特异性检测引物，其检测的灵敏度为3×103cfu/ml。cn110804670a中公开了一种基于rpa-lfs快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用，据副溶血弧菌不耐热溶血毒素(tlh)，耐热直接溶血毒素(tdh)，相对耐热直接溶血毒素(trh)的基因为靶序列设计引物，能在35℃-45℃，20min内可以得到检测结果，检测的检测下限为1cfu/反应。cn109680079a中公开了检测副溶血性弧菌的rpa引物、探针、试剂盒和方法，将irgb作为靶基因，并选择其特异性保守区域作为引物探针设计的靶标区域。可以用来快速检测样品中是否存在副溶血性弧菌的核酸，可以在15分钟就得到扩增结果，检测下限可以达到0.002ng/反应。
14、然而，食品领域检测基质复杂，食品中的糖、盐、和油脂等成分对于pcr检测的灵敏性有较大的影响(schrader,c.等，pcr inhibitors–occurrence,properties andremoval.journal ofapplied microbiology,113(5),1014-1026.)。因此评估不同食品基质对反应灵敏度的影响是开发针对食品基质快检方法的重要技术组成部分。上述文献中均未公开在复杂的食品基质中有效检出副溶血弧菌，也没有提供具有优异的特异性、灵敏性以及包容性的快检技术方案。
技术实现思路
1、本发明基于荧光探针-rpa检测技术原理，针对副溶血性弧菌设计特异性的引物和探针，依据相关标准要求，验证引物和探针的包容性、排他性和灵敏性；为了突破前增菌时间过长的技术瓶颈，本发明优化了副溶血性弧菌的前增菌培养条件，使用震荡培养的方式使前增菌的时间缩短至6小时；依据gb29921-2021食品安全国家标准《预包装食品中致病菌限量》的相关要求选择鱼露、三文鱼和海鲜饭团(水产品)作为食品基质，人工污染样本。同时应用gb 4789.7-2013食品安全国家标准《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》和本发明所建立的快检方法对污染的样品进行检测，快检方法的检出限lod50为3～7cfu/ml(不同的食品基质对方法的检出限略有影响)。总体看，本发明所建立的快检方法通过6小时的前增菌后，可在20min内完成对副溶血性弧菌的快检，检出限不高于国标方法gb4789.7的2.5倍，完全符合快检方法的评价标准《合格评定—微生物检测方法验证与确认指南》的验证要求。
2、为实现在复杂的食品基质中有效快速的检出副溶血弧菌，本发明提供一种用于检测副溶血弧菌的rpa引物。选择ncbi数据库中的基因(ay527396.1toxs基因)为引物和探针设计的靶基因。应用primer express软件开展引物设计工作，对设计的引物和探针进行筛选，从中筛选出灵敏性、特异性和包容性均表现突出的引物用于食品中副溶血弧菌的检测。其中，所述引物的上游引物序列为5’-aaagttgagcaagtgcttacatcaaatgaat-3’，其下游引物序列为5’-aatcgccattcggcaggtacttaacgttcga-3’。优选的，在所述上游引物的5’端进行biotin修饰。
3、本发明还提供一种用于检测食品中副溶血弧菌的rpa探针，其特征在于：所述探针的序列为5’-gactgtgattactgataacttgccagacga[fam-dt]ac[thf]g[bhq1-dt]aggcccgttacgtcga[c3 spacer]-3’；
4、其中，fam-dt为fam标记的荧光基团；thf为四氢呋喃残基；bhq1-dt为荧光淬灭基团；c3 spacer为c3阻断基团。
5、本发明还提供一种检测食品中副溶血弧菌的rpa的试剂盒，其包括前述的用于检测副溶血弧菌的rpa引物，更有选的，其还进一步包含所述的rpa探针。
6、本发明还提供一种检测食品中副溶血性弧菌的rpa组合物，所述组合物包含所述的rpa引物和所述的rpa探针。
7、同时，本发明还提供一种检测食品中副溶血弧菌的方法，其包括如下步骤：
8、(1)提取待测样品基因组dna；
9、(2)配制成rpa反应体系，其包含前述的rpa组合物以及步骤(1)提取的待测样品基因组dna；
10、(3)将步骤(2)配置的反应体系在恒温下进行扩增反应；
11、(4)根据扩增反应结果确定待测样品基因组dna中是否含有副溶血弧菌。
12、优选的，所述扩增反应结果基于荧光信号值判定；其中，所述荧光信号基于所述方法中加入rpa探针进行检测。更优选的，在步骤(1)之前进行前增菌的步骤，所述的增菌步骤是使用震荡培养的方式进行。更优选的，所述震荡培养的时间为6小时以上，优选6小时。
13、同时，本发明还提供一种rpa反应体系，所述反应体系为：
14、rpa反应buffer：29.4μl
15、所述上游引物(10μm)2μl
16、所述下游引物(10μm)2μl
17、所述探针(10μm)0.6μl
18、ddh2o 12.5μl
19、mg2+2.5μl
20、模板：1μl。
21、优选的，体系中mg2+终浓度为2-15mm，更优选14mm。进一步的，所述mg2+可以为氯化镁或醋酸镁溶液，优选醋酸镁溶液。
22、本发明的积极进步效果在于：
23、1、本发明设计的引物和探针具有优良的特异性和包容性。
24、2、本发明的相关结果显示，不同的食品基质对快检方法的灵敏度略有影响。在同一个靶点，不同位点设计引物和探针，扩增的效率截然不同。本发明设计多组引物并进行引物的灵敏性测试时，选择灵敏性、特异性以及包容性均表现出色的引物和探针组，用标准菌株测试，其lod50为114cfu/ml。增菌后建立的检测方法灵敏度为3～7cfu/ml。
25、3、本发明建立的快检方法的验证完全依据gb4789.45-2023《食品安全国家标准微生物检验方法验证通则》的相关要求，选择的食品基质较为完整。
26、4、本发明所建立的快检方法可以在7个小时内(增菌+检测)完成从样品收取到检测完成的全过程，快检方法与国标检测方法的rlod不高于2.5，完全符合gb4789.45-2023《食品安全国家标准微生物检验方法验证通则》的相关要求。
1.一种用于检测食品中副溶血性弧菌的rpa引物，其特征在于，其上游引物序列为5’-
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于：在所述上游引物的5’端进行biotin修饰。
3.一种用于检测食品中副溶血性弧菌的rpa探针，其特征在于：所述探针的序列为5’-
4.一种检测食品中副溶血性弧菌的rpa试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的引物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还进一步包含权利要求3所述的探针。
6.一种检测食品中副溶血性弧菌的rpa组合物，其特征在于：所述组合物包含权利要求1或2所述的rpa引物和权利要求3所述的rpa探针。
7.一种检测食品中副溶血性弧菌的方法，其包括如下步骤：
8.如权利要求7的方法，其特征在于：其进一步包括：
