本发明属于杂交瘤细胞生产应用，尤其涉及一种用于杂交瘤细胞制备的电融合缓冲液及其应用。
背景技术：
1、杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术，是指将免疫b淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合筛选得到单一克隆细胞，从而形成能分泌一种高度纯一单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术。这一技术的基础是细胞融合技术。常见的细胞融合方法是电融合，细胞电融合技术是上世纪80年代建立起来的一种新型促融合技术，其原理是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。该技术操作简单、对细胞的毒性相对低、可在显微镜直视下定向诱导细胞融合以及直接挑选杂交细胞、细胞融合率很高，但在施加电压过程中直接的电流冲击很容易导致细胞死亡，或者导致细胞存活数量少，生成效率差，造成电融合失败的情况。
2、为了提升克隆化效率，提高得到特异性抗体的成功率，得到抗体的高产量，现有技术针对了杂交瘤细胞的培养基进行调整，cn 103865880a公开了一种培养基及其制备方法，包括1640完全培养基和添加重组人il-21，可以促进新生成的杂交瘤细胞生长，同时增强杂交瘤细胞分泌特异性抗体的能力。但是，该方法需要待杂交瘤细胞生成后再改良其培养环境，本质上来说，仍受限于细胞融合效率以及细胞存活率。
3、为了提高细胞融合效率和细胞存活率，可通过在施加电脉冲之前对细胞进行适当的低渗处理和添加一定的保护剂成分，这样既能降低细胞的电导率，为细胞电融合提供稳定的融合环境，也能显著提高电融合效率同时保持细胞活性，为后续细胞分泌高度特异性抗体及扩大培养奠定了基础。因此，寻找一种用于杂交瘤细胞制备的电融合缓冲液是提高细胞融合效率和细胞存活率的一大关键。
技术实现思路
1、本申请提供了一种用于杂交瘤细胞制备的电融合缓冲液及其应用，以提高电融合法制备杂交瘤细胞的融合效率和细胞的活率，最大程度地提高筛选项目的阳性率。
2、为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种用于杂交瘤细胞制备的电融合缓冲液，包括以下组分：100-300 mm糖类、0.1-0.2 mm (ch3coo)2ca·h2o、0.1-0.2 mm(ch3coo)2mg·4h2o、0.05-0.2 % bsa。
3、进一步的，所述电融合缓冲液通过如下步骤制备：
4、按照电融合缓冲液配方，将各组分按配比称取，然后将称取的糖类、（ch3coo）2ca·h2o、（ch3coo）2mg·4h2o和bsa依次充分溶解于超纯水中，测定ph值后，定容至1000 ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌，于4℃保存备用。
5、进一步的，所述的糖类为葡萄糖、d-海藻糖或蔗糖中的任意一种。
6、进一步的，所述电融合缓冲液的ph为7.0–7.2。
7、本发明所述的电融合缓冲液中，糖类作为保护剂，能够维持细胞的渗透压及形成独特的保护膜，在电解质溶液及电融合过程中降低细胞受到的损伤，提高细胞的存活率；（ch3coo）2ca·h2o和（ch3coo）2mg·4h2o的导电性相对较弱，可降低对细胞的损伤；而牛血清白蛋白（bsa）能为细胞提供营养物质，具有保护细胞质的功用，提高了细胞融合时的效率和细胞存活率。因而，本发明所述电融合缓冲液中各组分之间的协同作用，能够有效维持融合细胞的渗透压，在细胞表面形成独特的保护膜，使融合细胞在电解质基质中及直流电压电穿孔作用中受到成分保护并快速修复，有利于杂交瘤细胞的存活及后续增殖。
8、为了解决上述技术问题，本发明目的之二提出了将电融合缓冲液应用于杂交瘤技术中，具体的，是一种将电融合缓冲液应用于制备杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
9、（1）制备小鼠脾细胞悬液及进行清洗计数，将小鼠脾细胞与预先培养的sp2/0骨髓瘤细胞以2∶1–5∶1的数量比例混合；
10、（2）将步骤（1）的细胞重悬于电融合缓冲液中，并使用该缓冲液离心清洗2次；
11、（3）将步骤（2）的细胞悬液加入到预先用缓冲液润洗的电融合仪的融合室；
12、（4）按照电融合程序进行脾细胞与sp2/0骨髓瘤的细胞融合，形成含有杂交瘤细胞的融合子；
13、（5）将电融合后的细胞悬液移加至hat培养基中，37℃培养箱孵育60 min使细胞适应恢复；
14、（6）将融合后细胞悬液加入铺有饲养细胞的96孔板中培养，后续筛选。
15、本发明将电融合缓冲液应用于杂交瘤细胞的制备过程中，用电融合缓冲液离心清洗2次小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞的混合细胞，能够更有效地洗去混合细胞中的杂质，解除其接触抑制。在电融合过程中电融合缓冲液能让细胞充分分散，同时保证细胞营养成分快速的转运，减少细胞电击损伤。而电融合后的细胞悬液移加至hat培养基后，在37℃培养箱孵育60 min，能够使细胞适应恢复，促进后期新生成的杂交瘤细胞生长。该方法有效地提升克隆化效率，提高得到特异性抗体的成功率。
16、进一步的，细胞融合密度控制在0.5-1×107个/ml。
17、进一步的，所述的电融合程序的是通过btx公司ecm2001+型融合仪操作完成的，具体的，其参数设置为：交流电压参数为：第一个交流电场为：初始电压vo1：30 v、峰值电压vf1：50 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20秒；第二个交流电场为：初始电压vo2：60v、峰值电压vf2：60 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20秒。
18、随后直流电脉冲参数为：直流脉冲电压600 v，作用时间50微秒，脉冲次数为１；最后一个交流电场初始电压vo3：50 v、峰值电压vf3：5 v，交流电场频率0.8 mhz，持续作用时间为7秒。
19、本发明的有益效果：
20、本发明通过各组分之间的协同作用，以及两个交流电流预排列程序使细胞形成充分排列的珍珠链状，增强细胞之间的接触面积，有效提高细胞在电融合过程中的活性、融合效率以及细胞融合率，总体提高了杂交瘤克隆形成率及活率，有利于阳性杂交瘤的筛选。该新型电融合缓冲液，能够有效维持融合细胞的渗透压，在细胞表面形成独特的保护膜，使融合细胞在电解质基质中及直流电压电穿孔作用中受到成分保护并快速修复，有利于杂交瘤细胞的存活及后续增殖。同时，能降低成本，本发明所需成本远远低于市售电融合缓冲液产品，达到降本增效的作用。
1.一种用于杂交瘤细胞制备的电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液包含以下成分：100-300 mm 糖类、0.1-0.2 mm（ch3coo）2ca·h2o、0.1-0.2 mm（ch3coo）2mg·4h2o、0.05-0.2 %bsa。
2.根据权利要求1所述的电融合缓冲液，其特征在于，包含以下成分：100 mm d-海藻糖、0.1 mm（ch3coo）2ca·h2o、0.1 mm（ch3coo）2mg·4h2o和0.1 %bsa。
3.根据权利要求1所述的电融合缓冲液，其特征在于，所述电融合缓冲液的ph值为7.0–7.2。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的电融合缓冲液于杂交瘤技术或单克隆抗体技术中的应用。
5.一种制备杂交瘤细胞的方法，应用如权利要求1-3任一项所述的电融合缓冲液，其特征在于，所述制备杂交瘤细胞的方法，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的细胞融合密度为0.5-1×107个/ml。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）的电融合程序为：（1）施加两个交流电压；（2）施加直流电脉冲后，再次施加交流电压。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述程序（1）的交流电压参数为：第一个交流电场为：初始电压vo1：30 v、峰值电压vf1：50 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20秒；第二个交流电场为：初始电压vo2：60 v、峰值电压vf2：60 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20秒。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述程序（2）的直流电脉冲参数为：直流脉冲电压600 v，作用时间50微秒，脉冲次数为1。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述程序（2）的交流电压参数为：交流电场初始电压vo3：50 v、峰值电压vf3：5 v，交流电场频率0.8 mhz，持续作用时间为7秒。
