本发明属于农业科学，具体涉及一种应用反转录酶联合重组酶依赖扩增技术检测方法与侧流层析试纸条检测方法相结合的实现马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒三重检测的方法及其应用。
背景技术：
1、烟草是我国重要的经济作物之一。烟草病毒病害种类繁多，在我国烟区发生普遍，分布广泛，是严重威胁烟草产量质量以及健康生产的第一大病害，并呈现出连年发生并间歇式暴发的流行态势。马铃薯y病毒属(potyvirus)病毒在世界范围内广泛分布，能够侵染多种经济作物引起严重病害。目前烟草上有三种侵染较为严重的马铃薯y病毒属病毒：马铃薯y病毒(potato virus y,pvy)、辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,chivmv)和烟草脉带花叶病毒(tobacco veinbanding mosaic virus，tvbmv)。pvy的田间症状可分为叶脉坏死和花叶等症状类型，花叶症状和烟草花叶病毒引起的花叶症状相似，但引起的坏死症状的坏死纹相比烟草花叶病毒离叶脉相对较近，并且常常很宽。chivmv侵染烟草的典型症状为褪绿、黄化、花叶、疱斑和卷叶。tvbmv侵染造成烟叶沿叶脉呈窄狭、深绿带状花叶症状，田间病株叶呈脉带和坏死斑纹，病叶先呈脉明，后出现脉带，茎上有浅色条纹，花冠杂色。然而近年来，烟草病毒病在田间多呈现复合侵染态势，症状更为严重难辨，使诊断和防治更加困难。
2、目前，针对烟草病毒病的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)，但该方法程序复杂，对仪器设备和检测条件要求高，需要具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用上受到很大的局限，无法满足现场及田间快速检测的需求。目前等温扩增检测技术已得到了广泛关注，因其对仪器依赖性低、扩增高效等优势，非常适合于快速检测，已在微生物快速检测领域得到了广泛应用，如重组酶聚合酶扩增技术(rpa)，与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,lfd)相结合则可使检测结果直接现场判读，无需要依赖电泳仪、凝胶成像系统和电脑等设备。虽然目前已有针对不同烟草病毒的单重检测试纸条，但是由于其每次只能进行一种病害的检测，检测效率低、耗时长且浪费试剂与检测材料。与传统的单重检测试纸条相比，三重检测试纸条具有更高的检测效率，同时也能够节省实验成本和时间，快速判别病害发生情况，对于及时发现和防控病害具有重大意义。
3、rpa技术是由英国twistdx inc公司开发出来的一种不同于pcr的核酸分子快速恒温扩增技术，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。该技术原理为：37℃恒温下，反应体系中的重组酶与引物紧密结合形成复合体，当引物在模板dna匹配到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-stranded dnabinding，ssb)的帮助下，模板dna解链，同时在dna聚合酶作用下形成新的dna互补链。反应产物以指数级增长，通常在1h内即能得到用琼脂糖凝胶电泳能够检测到的扩增产物。当在rpa反向引物中引入fam等分子标记，探针5’端引入生物素(biotin)标记，在离5’端约30碱基处修饰一个脱碱基位点(dspacer)或四氢呋喃(thf)时，该位点可作为dna修复酶作用的底物，被体系中的nfo核酶识别并切割，产生新的3’羟基末端，进而在dna聚合酶的作用下继续进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物同步累积，检测结果可特异性地被抗生物素的金标结合和抗分子标记捕获抗体的胶体金(gica)的侧流层析试纸条上显示。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。但是，目前国内外还没有将rt-rpa-侧流层析技术应用于三种烟草病毒pvy、chivmv和tvbmv进行三重检测的报道。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题和现状，本发明首次将三重rt-rpa-侧流层析检测技术应用于烟草病毒病检测领域，并提供了一种rt-rpa-侧流层析同步检测三种烟草病毒pvy、chivmv和tvbmv的引物对和探针及试剂盒，该方法可以同时准确、快速、简便检测pvy、chivmv和/或tvbmv的rpa，仅需通过对现场样品进行病毒rna粗提取并进行rt-rpa等温扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示而无须在pcr仪中进行扩增，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测快速等优点，适用于病毒田间检测，具有广泛的应用前景。
2、为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
3、第一方面，本发明一种烟草病毒三重rt-rpa-侧流层析等温检测的引物组合物，所述引物组合物包含三对引物序列，其用于同时检测马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的cp基因，所述引物组合物的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.6所示或与seq id no.1-seq id no.6的核苷酸序列具有至少90％，优选95％的序列一致性并且能够同时检测上述三个病毒。
4、发明人发现，在基于ncbi数据库中病毒分离物的多序列比较的基础上，找出病毒保守区，设计引物长度30-38bp，gc含量20-80％，扩增产物长度为100-400bp，在经过大量试验验证后，扩增筛选出可特异扩出目标片段的引物对若干，发明人发现本发明保护的引物对扩增效果最好。
5、在具体的实施例中，所述相似性可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
6、在具体的实施例中，所述引物组合物的反向引物还连接有标记分子。
7、优选地，所述标记分子连接在反向引物的5’端。
8、优选地，所述标记分子为荧光分子和/或地高辛，所述标记分子为荧光分子fam、荧光分子tamra或地高辛dig中的任意一种或至少两种。
9、优选地，检测马铃薯y病毒cp基因、辣椒脉斑驳病毒cp基因的反向引物5’端连接有荧光分子，检测烟草脉带花叶病毒cp基因的反向引物5’端连接有地高辛；优选为，检测马铃薯y病毒cp基因的反向引物5’端连接有荧光分子fam，检测辣椒脉斑驳病毒cp基因的反向引物5’端连接有荧光分子tamra，检测烟草脉带花叶病毒cp基因的反向引物5’端连接有地高辛dig。
10、所述引物组合物还包括三对探针序列，所述探针序列的核苷酸序列如seq idno.7-seq id no.12所示或与seq id no.7-seq id no.12的核苷酸序列具有至少90％，优选95％的序列一致性并且能够同时检测马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的cp基因。
11、发明人发现，基于筛选出的引物对，找出46-52bp长度的序列作为探针。
12、在具体的实施例中，所述相似性可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
13、在具体的实施例中，所述马铃薯y病毒cp基因、辣椒脉斑驳病毒cp基因和烟草脉带花叶病毒cp基因的探针和正向引物处于同一扩增方向。
14、在具体的实施例中，所述探针序列还连接有标记分子和/或保护标签。
15、优选地，所述标记分子为生物素；所述保护标签为防止聚合酶反应，优选为spacer3。
16、优选地，所述探针还连接有能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。
17、优选地，所述马铃薯y病毒cp基因的探针，其seq id no.7所示序列5’端连接有生物素，seq id no.8所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，seq id no.7所示序列3’端和seq id no.8所示序列5’端由能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。
18、所述辣椒脉斑驳病毒cp基因的探针，其seq id no.9所示序列5’端连接有生物素，seq id no.10所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，seq idno.9所示序列3’端和seq id no.10所示序列5’端由能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。
19、所述烟草脉带花叶病毒cp基因的探针，其seq id no.11所示序列5’端连接有生物素，seq id no.12所示序列3’端连接有防止聚合反应的保护标签，seq id no.11所示序列3’端和seq id no.12所示序列5’端由能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物。
20、第二方面，本发明提供一种rt-rpa-侧流层析三重检测的试剂盒，包含第一方面所述的引物组合物。
21、优选地，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条包括加样垫、加样孔、对照线c、检测线t1、t2和t3。
22、优选地，所述加样垫含有胶体金颗粒标记的第一标记分子特异结合物；所述对照线包被有第一标记分子的特异结合物；所述检测线t1包被有第二标记分子特异结合物；所述检测线t2包被有第三标记分子特异结合物；所述检测线t3包被有第四标记分子特异结合物。
23、所述第一标记分子特异结合物为链亲和素；所述第二标记分子特异结合物为抗fam抗体；所述第三标记分子特异结合物为tamra抗体；所述第三标记分子特异结合物为dig抗体。
24、优选地，所述试剂盒用于三重检测烟草上马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒。
25、第三方面，本发明提供一种用于三重检测烟草上马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的rt-rpa-侧流层析等温的检测方法，所述方法包括如下步骤：
26、s1、粗提待测样本的rna；利用第一方面所述的引物组合物或第二方面所述的试剂盒对所得的粗提rna进行rt-rpa扩增；
27、s2、使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判定样本中是否含有马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和/或烟草脉带花叶病毒。
28、判定方法：5分钟内，(1)当对照线c出现证明实验有效，此时t1、t2、t3检测线同时出现，说明同时存在pvy、chivmv和tvbmv，检出判定均为阳性结果；(2)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t1、t2检测线出现而t3不出现，说明有pvy、chivmv检出判定为阳性结果，而tvbmv未检出判定为阴性结果；(3)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t1、t3检测线出现而t2不出现，说明有pvy、tvbmv检出判定为阳性结果，而chivmv未检出判定为阴性结果；(4)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t1检测线出现而t2、t3不出现，说明有pvy检出判定为阳性结果，而未检出chivmv、tvbmv判定为阴性结果；(5)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t2检测线出现而t1、t3不出现，说明有chivmv检出判定为阳性结果，而未检出pvy、tvbmv判定为阴性结果；(6)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t2检测线出现而t1、t3不出现，说明有chivmv检出判定为阳性结果，而未检出pvy、tvbmv判定为阴性结果；(7)当对照线c出现证明实验有效，此时仅t3检测线出现而t1、t2不出现，说明有tvbmv检出判定为阳性结果，而未检出pvy、chivmv判定为阴性结果；(8)当对照线c出现证明实验有效，此时检测线均未出现，说明未检出pvy、chivmv、tvbmv判定为阴性结果；(9)当对照线c不出现时，说明实验无效，检测结果无意义。
29、优选地，所述步骤s1中rna粗提取过程为：取叶片组织约10-50mg，与200-400μlrna粗提取液混合，之后使用一次性研磨棒进行研磨。
30、优选地，所述步骤s1中rt-rpa扩增还需加入醋酸镁，所述醋酸镁的浓度为10-16nm，优选为14nm。
31、发明人发现，醋酸镁为rpa反应的所需的激动剂，加入后启动rpa反应。
32、优选地，所述步骤s1中rt-rpa扩增的引物/探针组合物的浓度为马铃薯y病毒cp基因的正向引物和反向引物各0.3μm、探针0.1μm，辣椒脉斑驳病毒cp基因的正向引物和反向引物各0.42μm、探针0.14μm，烟草脉带花叶病毒cp基因的正向引物和反向引物0.3μm、探针0.1μm。
33、发明人发现，通过调试三个检测靶标的引物/探针浓度，最终可达到在rpa体系中靶标模板量相同时，试纸条上三条检测线的显色程度相当。
34、优选地，所述步骤s1中rt-rpa扩增的引物/探针组合物的浓度范围为0.1-0.5μm/0.03-0.16μm，优选为为0.15-0.42μm/0.05-0.14μm。
35、在具体的实施例中，所述步骤s1中rt-rpa扩增体系为：制备总体积为47.5μl的混合液，其中马铃薯y病毒cp基因的正向引物(10m)和反向引物(10μm)各1.5μl、探针(10μm)0.5μl，辣椒脉斑驳病毒cp基因的正向引物(10μm)和反向引物(10μm)各2.1μl、探针(10μm)0.7μl，烟草脉带花叶病毒cp基因的正向引物(10μm)和反向引物(10μm)各1.5μl、探针(10μm)0.5μl，a缓冲液29.4μl，rna粗提物2μl，ddh2o 4.2μl。
36、所述步骤s1中rt-rpa扩增反应为：将上述混合液加入到含有twistamp rt-rpa-nfo冻干酶粉的反应管中充分混匀后，再加入2.5μl的醋酸镁(280mm)，混匀反应。
37、所述s2的具体步骤为：取三重检测试纸条于室温平衡；取步骤s1中的扩增产物用ddh2o稀释20倍后滴加于试纸条的加样孔中5min后读取结果。
38、所述步骤s1中所述缓冲液成分包含6％peg 200和20mm naoh。
39、优选地，所述步骤s1中rt-rpa扩增的反应条件为：35-40℃的恒温金属浴中温浴25-32min，优选为39℃的恒温金属浴中温浴30min
40、发明人发现，通过调试三个检测靶标的引物/探针浓度组合、扩增时间、反应温度以及醋酸镁浓度，最终可达到在rt-rpa体系中三靶标模板量相同时，试纸条上三条检测线的显色程度相当。
41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
42、(1)本发明克服了三套特异性引物和探针同一体系扩增时存在的问题，实现可同时鉴别检测pvy、chivmv和/或tvbmv的目标；
43、(2)本发明首次采用rt-rpa-侧流层析技术建立同时快速检测pvy、chivmv和tvbmv的方法，并通过特异性、灵敏性和应用评价，为pvy、chivmv和tvbmv的检测提供一种可靠的新方法；
44、(3)本发明将rt-rpa扩增与侧流层析试纸条相结合使检测结果可直接现场判读，从而实现pvy、chivmv和tvbmv的分子检测现场化、快速化。
1.一种烟草病毒三重rt-rpa-侧流层析等温检测的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包含三对引物序列，其用于同时检测马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的cp基因，所述引物组合物的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.6所示或与seqid no.1-seq id no.6的核苷酸序列具有至少90％，优选95％的序列一致性并且能够同时检测上述三个病毒。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物的反向引物还连接有标记分子；
3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括三对探针序列，所述探针序列的核苷酸序列如seq id no.7-seq id no.12所示或与seq id no.7-seq id no.12的核苷酸序列具有至少90％，优选95％的序列一致性并且能够同时检测马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的cp基因。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述探针序列还连接有标记分子和/或保护标签；
5.一种rt-rpa-侧流层析三重检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4中任一项所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条包括加样垫、加样孔、对照线c、检测线t1、t2和t3；
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于三重检测烟草上马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒。
8.一种用于三重检测烟草上马铃薯y病毒、辣椒脉斑驳病毒和烟草脉带花叶病毒的rt-rpa-侧流层析等温的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8中所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中rna粗提取过程为：取叶片组织约10-50mg，与200-400μl rna粗提取液混合，之后使用一次性研磨棒进行研磨。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中rt-rpa扩增还需加入醋酸镁，所述醋酸镁的浓度为10-16nm，优选为14nm；
