本发明涉及ph荧光探针，具体涉及监测线粒体自噬的花菁类ph荧光探针及制备和应用。
背景技术：
1、线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，通过有氧呼吸的方式产生活性氧与三磷酸腺苷，是多种关键代谢过程的发生场所，维持线粒体稳态对细胞生长至关重要。线粒体会在大量活性氧、营养缺乏、细胞衰老等作用下发生去极化导致严重损伤，为了维持线粒体的数量和质量，细胞会启动线粒体自噬过程，将损伤线粒体包裹进自噬体囊泡中并与溶酶体融合，完成线粒体降解与营养物质的循环再利用，从而维持细胞内微环境的稳定。该过程的异常会导致某些疾病，包括神经退行性疾病、心血管疾病及代谢性疾病等。因此，实时监测线粒体自噬过程对于研究与其相关联的疾病具有重要意义。线粒体自噬过程会导致线粒体由正常生理状态下的ph～8.0降低至ph～5.5-6.5，这一特点使ph成为监测线粒体自噬过程的理想靶标。开发一种能够实时、准确检测线粒体ph值的方法，对于了解线粒体在生理和病理条件下的关键功能具有重要意义。
2、小分子荧光探针具有无创性、灵敏度高、特异性强的优点，已被广泛应用于对活细胞中的生理过程进行成像。设计用于监测活细胞中线粒体自噬过程的探针应该满足三个“基本要求”：优异的线粒体靶向性、在线粒体自噬ph变化区间存在响应和发射波长位于生物成像的”“近红外窗口”(650nm-900nm)。目前报道的线粒体自噬探针，主要以萘酰亚胺或罗丹明作为母体，然而这两种结构的发射波长大多低于650nm。相比之下，花菁类染料固有的阳离子结构有利于实现对线粒体的靶向，同时发射波长可以调节至“近红外窗口”，是一类用于监测活细胞中线粒体自噬过程的理想的荧光探针母体结构。应用最为广泛的多甲川花菁染料由于两端吲哚的氮原子均被取代，不具备与质子结合的能力。可以通过不对称合成策略，暴露结构一端的吲哚氮原子实现花菁对ph的响应，但是这种方式破坏了染料固有的线粒体靶向能力。
3、尽管近年来在开发线粒体自噬荧光探针方面取得了一定进展，特别是利用花菁类染料尝试解决近红外成像和线粒体靶向的需求，但是这些进展大多集中在单一性能的改进，未能全面整合所有必要的特性，往往面临着如下问题：
4、综合性能整合困境：在追求增强ph响应特性的过程中，很多探针设计不得不牺牲其固有的线粒体靶向特性或是荧光信号强度，特别是在引入新的功能基团以实现ph敏感性时，这种平衡尤为难以把握。如何在不损害原有性能基础上增加新的功能，成为亟待突破的技术瓶颈。
5、特异性和灵敏度的平衡：现有探针在实际应用中，常因非特异性结合或对细胞微环境其他变化的交叉响应，导致信号解析度不高。尤其在复杂的生理或病理状态下，如何确保探针仅对线粒体自噬相关的ph变化产生响应，而不受其他因素干扰，是一个亟需解决的问题。
6、生物相容性与长期监测的矛盾：虽然一些探针在短期内展现了良好的生物相容性，但在进行长时间或活体监测时，其稳定性和安全性仍面临考验。如何确保探针在长期滞留细胞内或生物体内时，既能持续发挥监测作用，又不引起细胞毒性或生物机能干扰，是推进此类技术临床应用的关键。
7、精准量化与实时监测的难题：现有技术在精确量化线粒体ph变化，尤其是在动态追踪自噬过程中的细微变化时，往往缺乏足够的灵敏度和精确度。这限制了我们深入理解线粒体自噬机制与疾病关联性的能力。
8、因此需要针对这些问题开发新型的以多甲川花菁染料为骨架的线粒体自噬探针，从而克服目前存在的缺陷，使其具备更加的成像、标记和检测的能力。
技术实现思路
1、为克服现有线粒体自噬探针的一系列缺陷，提供了一类新型不对称多甲川花菁近红外荧光染料、其合成方法和应用。
2、本技术的第一方面在于保护一类新型不对称多甲川花菁近红外荧光染料，所述的染料具有通式i的结构：
3、
4、通式i中：
5、r1选自氢、卤素、甲氧基、氨基、硝基、羟基、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸基、具有1-18个碳的酯基、具有1-18个碳的酰胺基的一种；
6、r2或r3各自独立的选自氢、1-18个碳的烷基、具有1-18个碳的羧烷基、芳基、芳基羧酸基、具有1-18个碳的烷基磺酸根、芳基磺酸根、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐的一种；
7、r4为不定位置的取代基，选自氢、卤素、具有1-18个碳的羧烷基、具有1-18个碳的羟基烷基、具有1-18个碳的烷基磺酸基、具有1-18个碳的酯基、具有1-18个碳的酰胺基的一种；
8、n选自2、3或4；
9、x-选自卤素离子、clo4-、bf4-、ch3coo-、cf3coo-或ots-的一种；更优选自氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、clo4-、ch3coo-的一种。
10、对于上文所述的技术方案而言，r1更优选自氢、卤素、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
11、所述具有1-8个碳的酯基为-coor；更优选自c1-c8的烷基酯基、c1-c8的环烷基酯基、c1-c8的芳基酯基中的一种：
12、c1-c8的烷基酯基，例如：甲基酯(-cooch3)、乙基酯(-cooch2ch3)等。
13、c1-c8的环烷基酯基：如环丙基酯、环丁基酯等。
14、c1-c8的芳基酯基：r为苯基或芳基等。
15、具有1-8个碳的酰胺基指的是-c(o)nr2官能团，更优选自c1-c8的烷基酰胺基、c1-c8的环烷基酰胺基、c1-c8的芳基酰胺基中的一种：
16、c1-c8的烷基酰胺基：r为氢或烃基，即甲酰胺(-conh2)、乙酰胺(-conhch3)等。
17、c1-c8的环烷基酰胺基：r为环状结构，例如：环丙基或环己基等。
18、c1-c8的芳基酰胺基：r为苯基或芳基，例如：甲基苯基、乙基苯基、萘、蒽等。
19、对于上文所述的技术方案而言，r2或r3各自独立的更优选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸根、芳基中的一种；
20、所述具有c1-c8的烷基，例如：甲基、乙基；
21、c1-c8的烷基磺酸基，例如：甲基磺酸基、乙基磺酸基；
22、c1-c8的烷基芳基，例如：甲基苯、乙基苯、甲基萘、乙基萘、甲基蒽、乙基蒽。
23、r2或r3各自独立的更优选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、丙基、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸丙酯、丁酸丁酯、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、甲基磺酸基、乙基磺酸基、丙基磺酸基、丁基磺酸基、苯甲酸基中的一种。
24、对于上文所述的技术方案而言，r4优选自氢、具有1-8个碳的羧烷基、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基的一种；
25、c1-c8的羧烷基，例如：甲酸基、乙酸基；
26、所述具有1-8个碳的酯基为-coor；更优选自c1-c8的烷基酯基、c1-c8的环烷基酯基、c1-c8的芳基酯基中的一种：
27、c1-c8的烷基酯基，例如：甲基酯(-cooch3)、乙基酯(-cooch2ch3)等。
28、c1-c8的环烷基酯基：如环丙基酯、环丁基酯等。
29、c1-c8的芳基酯基：r为苯基或芳基等。
30、具有1-8个碳的酰胺基指的是-c(o)nr2官能团，更优选自下述取代基中的一种：
31、c1-c8的烷基酰胺基：r为氢或烃基，即甲酰胺(-conh2)、乙酰胺(-conhch3)等。
32、c1-c8的环烷基酰胺基：r为环状结构，例如：环丙基或环己基等。
33、c1-c8的芳基酰胺基：r为苯基或芳基，例如：甲基苯基、乙基苯基、萘、蒽等。
34、本技术的第二方面在于保护一类新型不对称多甲川花菁近红外荧光染料的合成方法，包括以下步骤：
35、
36、步骤1：在60-120℃下，将y-1和3-甲基-2-丁酮加入到有机溶剂i中，其中y-1和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1:1-5；更优选为1:1.5，搅拌3-12h后，蒸发溶剂，将残留物加入到酸溶液中，在80-150℃之间搅拌0.5-4h，用碱调节ph至碱性，萃取、浓缩、纯化，得到中间产物y-2；
37、步骤2：在有机溶剂ii中，在40-100℃下，将y-2与n烷基化试剂反应3-24h，经过重结晶得到中间体y-3，其中，化合物y-2和n烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；更优选为1:3-8；
38、步骤3：在有机溶剂iii中，在60-120℃下，将y-3与s-1搅拌反应0.5-5h，经过重结晶得到中间体s-2；y-3与s-1的摩尔比为1:1-5，更优选为1:2；m选自2、3或4
39、步骤4：在有机溶剂ⅳ中，在40-100℃下，将y-4与n烷基化试剂反应3-24h，经过重结晶得到中间体y-5，其中，化合物y-4和n烷基化试剂的摩尔比为1:1-10；更优选为1:3-8。
40、步骤5：在60-120℃下，将s-2与y-5溶解在有机溶剂v中，在碱的催化下发生缩合反应，经过重结晶和硅胶柱纯化，得到新型不对称多甲川花菁近红外荧光染料ⅰ。
41、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述有机溶剂i选自甲苯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃中的一种；
42、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，步骤1中的酸选自乙酸、盐酸、硫酸、聚磷酸中的任意一种；
43、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述有机溶剂ii选自丙酮、乙腈、甲醇、甲苯、邻二氯苯、dmf的一种；
44、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述有机溶剂iii选自乙醇、乙酸、乙酸酐的一种或几种的混合溶剂；
45、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述有机溶剂ⅳ选自丙酮、乙腈、甲醇、甲苯、邻二氯苯、dmf的一种；
46、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述有机溶剂ⅴ选自dmf、乙醇、异丙醇、乙酸酐中的一种；
47、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述n烷基化试剂选自甲基卤代烃、乙基卤代烃、丙基卤代烃、甲酸甲酯卤代烃、甲酸乙酯卤代烃、乙酸乙酯卤代烃、丙酸丙酯卤代烃、丁酸丁酯卤代烃、甲酰胺卤代烃、乙酰胺卤代烃、丙酰胺卤代烃、丁酰胺卤代烃、甲基磺酸基卤代烃、乙基磺酸基卤代烃、丙基磺酸基卤代烃、丁基磺酸基卤代烃、苯甲酸基卤代烃中的一种；
48、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述在上述步骤1或5中，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠中的一种；
49、对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述在上述步骤2、3、4中，重结晶溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、丙醇的任意一种或几种组合的混合溶剂。
50、本发明所述探针的应用包括在基础科学研究、药物作用机制评估、细胞生理功能与疾病模型分析、环境污染物效应监测、再生医学中线粒体功能调控、以及生物标志物发现与验证中的应用。
51、基础科学研究：在细胞生物学领域，本发明所述的探针可作为强大的工具，帮助科学家深入研究线粒体自噬的分子机制，包括其触发因素、调控途径以及在细胞应激反应、能量代谢和细胞死亡中的作用。
52、细胞功能评估：应用于评估不同细胞类型或在不同生理及病理状态下线粒体自噬的动态变化，例如：在细胞老化、应激反应、代谢失调等研究中，通过监测线粒体内ph的变化来评估线粒体健康状态和自噬活性。
53、药物筛选与毒性测试：在新药研发过程中，利用该探针评估化合物对线粒体自噬过程的影响，可作为早期筛选具有调节线粒体自噬活性潜力药物的工具，同时也能在体外模型中检测药物候选物的细胞毒性，特别是那些可能影响线粒体功能的药物。
54、生物标志物发现：在细胞模型或组织样本中，通过监测线粒体自噬的动态变化，有助于识别与线粒体功能障碍相关的生物标志物，进而促进对复杂疾病机理的理解，虽然不直接诊断疾病，但能为疾病机制研究提供重要线索。
55、细胞工程与再生医学：在干细胞分化、组织工程和再生医学研究中，该探针可以辅助监测和调控线粒体状态，以优化细胞培养条件，提高细胞活力和分化效率，对细胞治疗和组织修复策略的开发具有潜在价值。
56、环境与毒理学研究：用于评估环境污染物或化学物质对细胞线粒体自噬的影响，为环境污染监控和化学品安全评估提供一种新的分析手段。
57、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
58、(1)本发明所述的监测线粒体自噬的不对称多甲川花菁类ph荧光探针，首次实现直接应用拥有优异光物理性质的多甲川花菁染料对ph进行响应，合成步骤简单，成本低廉，易于大规模生产，具有潜在的商品化应用价值。
59、(2)所述探针对ph变化的识别原理：所述探针以对称多甲川花菁染料为母体，通过将对称花菁染料的一端更换为氮杂吲哚结构，合成不对称多甲川花菁染料结构，释放吲哚氮原子作为h+的结合位点。当h+与吲哚氮原子反应位点结合后，不对称多甲川花菁染料结构原有的分子内电荷转移效应大幅度减弱，导致原本结构吸光度下降，荧光淬灭。与h+解离后的结构则会吸光度上升，荧光增强。通过巧妙的结构设计，探针实现了对ph变化的快速、可逆响应。
60、(3)cy5.5-h-cyn在ph值从9.0降至4.0的过程中，其在不同波长下的吸光度和荧光强度发生了明显的变化。具体而言，680nm处的吸光度逐渐降低，526nm处的吸光度逐渐上升；同时，710nm处的荧光强度逐渐降低，而662nm处的荧光亮度逐渐上升。在存在各种生物干扰物(如金属离子、活性氧物质、生物硫醇及氨基酸等)的情况下，cy5.5-h-cyn显示出良好的特异性，即其荧光强度没有因这些干扰物的存在而发生显著变化。所述探针对ph具有高灵敏度与高特异性，可以对ph实现快速响应，不受环境极性，粘度和生物体系其他物质的干扰。
61、(4)所述探针pka值为6.46，ph响应线性范围为5.0-7.0，这与线粒体自噬过程中的ph变化相匹配，非常适合对线粒体自噬过程中线粒体内ph值的监测。
62、(5)所述探针利用结构固有的正电荷结构与线粒体负性膜电位的静电作用相结合，使探针靶向聚集于线粒体中，同时探针本身的结构特点使探针进一步固定于线粒体内；应用于线粒体自噬过程中线粒体ph变化监测时，可有效抵御自噬过程中微环境变化(如线粒体碱化和膜去极化造成线粒体膜电位降低等)的影响，具有高灵敏、可靠性、可视化、快速便捷等特点，预示其在线粒体相关生物研究与医疗诊断方面具有良好的应用前景。
63、(6)所述的检测手段简单高效，兼容常用的荧光成像设备，只需包括荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜，便于普及应用。
64、(7)生物相容性与低毒性：本发明的探针在设计时考虑了生物安全性，经过细胞毒性测试，证明其对细胞生长和代谢活动影响较小，适合作为长期监测工具，这对于开展体内研究和潜在的临床转化尤为重要。
65、(8)光稳定性：相较于其他荧光探针，本发明的探针具有卓越的光稳定性，在长时间光照或反复照射条件下仍能保持稳定的荧光输出，确保了数据的可靠性和重复性。
1.一类新型不对称多甲川花菁近红外荧光染料，其特征在于：所述的染料具有通式i的结构：
2.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：所述r1选自氢、卤素、具有1-8个碳的酯基、具有1-8个碳的酰胺基中的一种。
3.根据权利要求2所述的染料，其特征在于：所述具有1-8个碳的酯基选自c1-c8的烷基酯基、c1-c8的环烷基酯基、c1-c8的芳基酯基中的一种；所述具有1-8个碳的酰胺基选自c1-c8的烷基酰胺基、c1-c8的环烷基酰胺基、c1-c8的芳基酰胺基中的一种。
4.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：所述r1选自氢、卤素、甲基酯、乙基酯、环丙基酯、环丁基酯、苯基、芳基、甲酰胺、乙酰胺、环丙基、环己基、甲基苯基、乙基苯基、萘、蒽中的一种。
5.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：所述r2或r3各自独立的选自氢、具有1-8个碳的烷基、具有1-8个碳的烷基磺酸根、芳基中的一种。
6.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：所述r2或r3各自独立的选自氢、甲基、乙基、甲基磺酸基、乙基磺酸基、甲基苯、乙基苯、甲基萘、乙基萘、甲基蒽、乙基蒽中的一种。
7.根据权利要求1所述的染料，其特征在于：所述r2或r3各自独立的选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、丙基、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸丙酯、丁酸丁酯、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、甲基磺酸基、乙基磺酸基、丙基磺酸基、丁基磺酸基、苯甲酸基中的一种。
8.如权利要求1所述的染料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的染料的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂i选自甲苯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃中的一种；
10.如权利要求1所述染料的应用，其特征在于：包括所述染料在基础科学研究、药物作用机制评估、细胞生理功能与疾病模型分析、环境污染物效应监测、再生医学中线粒体功能调控、以及生物标志物发现与验证中的应用。
