本发明涉及医疗卫生，具体涉及一种去分化天山雪莲细胞的制备方法及其抗皱紧致应用。
背景技术：
1、天山雪莲被誉为“百草之王”，其根部、茎、叶富含生物碱、黄酮类、挥发油、内脂、甾体类、多糖及还原性物质，具有活血通络、散寒除湿等功效，可治疗多种疾病，如风湿性关节炎等。
2、由于过度采集和栖息地破坏，野生天山雪莲的数量锐减，已被列为国家二级保护植物。为了保护这一珍稀资源，在人工控制的最优条件下通过植物细胞培养技术培育出去分化天山雪莲细胞，不仅保留了野生天山雪莲的化学成分和药理作用，甚至在某些活性成分上超越野生品种，此外，细胞培养技术还能避免农残和重金属污染，确保了产品的安全性。去分化植物细胞起源于haberland在1902年的研究。在过去的40年中，植物细胞培养物已经被用于感兴趣的代谢产物的生产以及完全一样的植株的增殖(体细胞胚胎发生)。这种植物生物技术是基于细胞全能型的概念：“任何一个植物细胞能够去分化并且再生成另一个与所述细胞来源相同的新个体”。去分化植物细胞是来源于器官(叶、茎、根、花瓣等)的植物细胞，其经过培养、再次生成它的去分化形式，即失去了它的叶、茎、根、花瓣的特异性，能够再次生成完整的植株。未分化植物细胞相当于源自植物分生组织细胞的真正的植物干细胞，并且不具有器官特异性的生物学历史。
3、天山雪莲的护肤功效包括保湿滋润、抗氧化、抗炎、淡化色斑、抗衰老和抗皱等。这些特性使得雪莲花提取物成为化妆品行业中的宝贵成分。通过植物细胞培养技术生产的天山雪莲干细胞，可以作为天然成分用于开发抗皱紧致等护肤产品，为化妆品市场提供了新的选择。
4、可见，天山雪莲的保护和可持续利用不仅对生物多样性保护具有重要意义，而且对开发新型天然药品和化妆品具有巨大的经济潜力。通过现代生物技术的应用，可以实现这一珍稀植物资源的有效保护和合理利用。例如现有技术cn104498425b公开了一种雪莲干细胞的分离培养方法及在制备抗衰老产品中的应用。具体是取天山雪莲幼嫩叶片，对其消毒后首先利用固体培养基分离天山雪莲干细胞，再利用液体培养基对其进行传代配养；所述固体培养基含有无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和活性炭；液体培养基含有无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和添加物。该专利以保护眼霜为主。cn110923190a是一种提高雪莲细胞培养物黄酮苯丙素类化合物的方法，所述方法中使用的培养基中，磷元素浓度0.5-3mmol/l，no3-离子浓度20-35mmol/l，nh4+离子浓度0-30mmol/l，ca2+离子浓度0.5-3mmol/l，mg2+离子浓度为0.2-1.5mmol/l，硼离子浓度0.02-0.1mmol/；在培养基中可添加诱导剂或前体或旁路代谢抑制剂；最终显著提高了雪莲细胞培养物的总黄酮含量及芦丁、绿原酸、紫丁香苷、1,5二咖啡酰奎尼酸的含量。cn116103219b涉及一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂，属于医疗卫生领域，该雪莲干细胞粉的制备方法，其制备步骤如下：选择天山雪莲未分化的根部末端作为外植体，先进行清洗、消毒预处理，之后在一定条件下对其进行初代培养和传代培养，之后在一定条件进行扩大培养，最后进行过滤、干燥等后处理步骤，可以制得具有较佳愈合作用的雪莲根部干细胞冻干粉。cn106867958a一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：1)天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织；2)摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，颜色鲜亮，质地紧实的固体细胞放入含有培养液的摇瓶中，每7-10天继代一次；3)摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7-10天；通过优化培养条件和控制溶氧量，实现了细胞的均匀分散和有效成分含量的提高。这种工艺更有利于天山雪莲细胞中有效成分的均衡产生，为研发人员提供一种更加高效和稳定的天山雪莲细胞培养方法，等等。
5、尽管在前人的研究基础上，天山雪莲干细胞制备方法及应用已有所提高，但要满足工业化生产的需求，还有待研发人员提供更多的方法。
技术实现思路
1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种去分化天山雪莲细胞的制备方法及其抗皱紧致应用，本发明通过利用植物细胞培养技术来生产天山雪莲(saussurea involucrata)干细胞，其活性成分含量高、培养周期短、细胞产量高，且这些富含活性成分的天山雪莲干细胞冻干粉具有抗皱紧致功效，为护肤品行业带来了一种全新的、天然来源的抗皱紧致成分。
2、一方面，本发明提供一种去分化天山雪莲细胞制备方法，具体步骤如下：
3、s1：取无菌苗根尖转接至诱导培养基，增殖形成细胞团；取细胞团至含有增殖培养基的培养皿中培养，得到初级天山雪莲干细胞；
4、s2：将所得初级天山雪莲干细胞转移至液体ms培养基中悬浮培养，同时改变光照条件，培养获得总黄酮含量、绿原酸含量明显增加的天山雪莲干细胞。
5、进一步地，所述无菌苗根尖取自生长期至10天苗龄期的天山雪莲无菌苗。进一步地，所述天山雪莲无菌苗的培育过程为：取天山雪莲种子，清洗后，经预处理、浸泡、漂洗后接种培育获得。进一步地，所述清洗运用自来水冲洗20～30min。进一步地，所述预处理是指用100mg/l ga3(赤霉素)溶液进行预处理12h。进一步地，所述浸泡是用70％的乙醇浸泡30s。进一步地，所述漂洗是指用1％的次氯酸钠溶液震荡漂洗8～10min。进一步地，所述接种培育的培养基为含蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms培养基。
6、进一步地，本发明所述ms培养基为含有如表1所示组分的培养基，基本物质组成为：nh4no3 412.5mg/l、na2moo4·2h2o 0.25mg/l、cacl2 332.2mg/l、ki 0.83mg/l、mgso4180.7 mg/l、znso4·7h2o 8.6mg/l、kno3 475mg/l、cuso4·5h2o 0.025mg/l、kh2po4170mg/l、fenaedta 36.7mg/l、h3bo3 6.2mg/l、mnso4·h2o 16.9mg/l、cocl2·6h2o 0.025mg/l、glycine 2mg/l、inositol 100mg/l、nicotinic acid
7、0.5mg/l、pyridoxine hcl 0.5mg/l、thiamine hcl 0.1mg/l。
8、进一步地，所述接种培育的条件为25℃的温度、12h光照/12h黑暗的光周期。
9、进一步地，所述诱导培养基为含1.0mg/l iba(吲哚丁酸)、0.5mg/l kt(激动素)、30g/l蔗糖和6g/l agar(琼脂)的ms培养基，ph值调至5.8-6.2。进一步地，s1中增殖形成细胞团的培养条件为置于25℃的黑暗环境下培养14d。
10、进一步地，所述增殖培养基为含蔗糖和激素的ms培养基。进一步地，所述激素选自6-苄基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、iaa、naa中至少一种。进一步地，所述激素选自0.5mg/l 6-ba+1.0mg/l 2,4-d的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/l 2,4-d的组合、1.0mg/l6-ba+1.0mg/l 2,4-d的组合、1.0mg/l 6-ba+2.0mg/l 2,4-d的组合、0.5mg/l6-ba+2.0mg/liba的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/l iaa的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/lnaa的组合、2.0mg/l 2,4-d、0.5mg/l 6-ba中至少一种。进一步地，所述增殖培养基为含30g/l蔗糖、0.5mg/l6-苄基氨基嘌呤、2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸的ms培养基。进一步地，所述增殖培养基需高压灭菌锅在121℃的温度和0.1mpa的压力下灭菌20min。进一步地，s1中，增殖培养的条件为将天山雪莲干细胞置于25℃的黑暗环境下培养14d。
11、进一步地，所述液体ms培养基含有诱导剂、蔗糖、6-ba(6-苄基氨基嘌呤)和2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)。进一步地，所述诱导剂选自l-苯丙氨酸和mt(褪黑素)中至少一种。进一步地，所述液体ms培养基含有50mg/l l-苯丙氨酸、20mg/l的mt(褪黑素)、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-ba(6-苄基氨基嘌呤)和2.0mg/l 2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)。进一步地，所述液体ms培养基的ph值5.8-6.2。进一步地，所述液体ms培养基在接种初级天山雪莲干细胞前，经过高压灭菌处理。进一步地，所述高压灭菌条件为在高压灭菌锅中，121℃的温度和0.1mpa的压力下灭菌20min。通过高压灭菌确保诱导培养的环境的安全可靠无菌。
12、进一步地，所述光照条件为选择不同的光，光照总强度为32μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。进一步地，所述不同光选自红光、白光、蓝光或黑暗中至少一种。进一步地，所述不同光指采用红光和蓝光按1：1方式使用，其中，蓝光中心波长为457nm，红光中心波长为660nm。
13、进一步地，s2中培养条件为温度为25℃，转速为100rpm，培养至第4-6天。
14、另一方面，本发明提供一种本发明所述方法制备的天山雪莲干细胞在具有抗皱紧致功效的用品中的应用。所述用品可以是化妆品、冻干粉剂等。
15、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
16、本发明采用天山雪莲无菌苗根尖作为外植体，在本技术的制备方法下，可以获得具有较好抗皱紧致功效的用品(例如化妆品、冻干粉剂等)，具有良好的抑制基质金属蛋白酶1(mmp-1)的分泌功效，能提升i型胶原(collagen i)蛋白、ⅲ型胶原(collagen iii)蛋白和iv型胶原(collgenⅳ)蛋白含量，进而达到抗皱紧致功效。
17、本发明方法通过植物细胞培养技术实现天山雪莲干细胞的规模化生产，解决了天然资源稀缺的问题，实现原料珍稀但可持续。
18、本发明采用独特的培养条件、诱导剂组合，提高了雪莲干细胞的活性和活性成分含量，实现工艺创新。
19、本发明制备的天山雪莲干细胞为护肤品行业提供了一种具有抗皱紧致功效的安全原料。
20、下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
1.一种去分化天山雪莲细胞制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述无菌苗根尖取自生长期至10天苗龄期的天山雪莲无菌苗；所述天山雪莲无菌苗的培育过程为：取天山雪莲种子，清洗后，经预处理、浸泡、漂洗后接种培育获得。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述清洗运用自来水冲洗20～30min；所述预处理是指用100mg/l ga3溶液进行预处理12h；所述浸泡是用70％的乙醇浸泡30s；所述漂洗是指用1％的次氯酸钠溶液震荡漂洗8～10min；所述接种培育的培养基为含蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms培养基；所述接种培育的条件为25℃的温度、12h光照/12h黑暗的光周期。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述诱导培养基为含1.0mg/l iba、0.5mg/l kt、30g/l蔗糖和6g/l agar的ms培养基，ph值调至5.8-6.2；进一步优选地，s1中增殖形成细胞团的培养条件为置于25℃的黑暗环境下培养14d。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述增殖培养基为含蔗糖和激素的ms培养基；进一步优选地，所述激素选自6-苄基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、iaa、naa中至少一种；进一步优选地，所述激素选自0.5mg/l 6-ba+1.0mg/l 2,4-d的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/l 2,4-d的组合、1.0mg/l 6-ba+1.0mg/l 2,4-d的组合、1.0mg/l6-ba+2.0mg/l 2,4-d的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/l iba的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/liaa的组合、0.5mg/l 6-ba+2.0mg/l naa的组合、2.0mg/l 2,4-d、0.5mg/l 6-ba中至少一种。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述增殖培养基为含30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤、2.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸的ms培养基；进一步优选地，所述增殖培养基需高压灭菌锅在121℃的温度和0.1mpa的压力下灭菌20min；进一步优选地，s1中，增殖培养的条件为将天山雪莲干细胞置于25℃的黑暗环境下培养14d。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，s2中，所述液体ms培养基含有诱导剂、蔗糖、6-ba和2,4-d；进一步优选地，所述诱导剂选自l-苯丙氨酸和mt中至少一种。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述液体ms培养基含有50mg/l l-苯丙氨酸、20mg/l的mt、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-ba和2.0mg/l 2,4-d；进一步地，所述液体ms培养基的ph值5.8-6.2；进一步地，所述液体ms培养基在接种初级天山雪莲干细胞前，经过高压灭菌处理；进一步地，所述高压灭菌条件为在高压灭菌锅中，121℃的温度和0.1mpa的压力下灭菌20min。
9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述光照条件为选择不同的光，光照总强度为32μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d；进一步优选地，所述不同光选自红光、白光、蓝光或黑暗中至少一种；进一步优选地，所述不同光指采用红光和蓝光按1：1强度比例使用，其中，蓝光中心波长为457nm，红光中心波长为660nm；
10.一种权利要求1～9任一项所述方法制备的去分化天山雪莲细胞在具有抗皱紧致功效的用品中的应用；进一步地，所述用品为化妆品或冻干粉剂。
