本发明涉及寄生虫检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a精准快速检测弓形虫的检测试剂盒及一管法检测方法。
背景技术：
1、弓形虫(toxoplasma gondii)是一种顶复门(phylum apicomplexa)原生动物，可寄生于包括人在内的几乎所有温血动物，引起人畜共患寄生虫病。弓形虫典型的基因型包含i型、ii型和iii型，弓形虫的致病性与虫株的基因型和毒力相关，其中人易感染ii型虫株，动物更易感染i型和iii型。据统计，犬、猫的弓形虫感染率达到6％-88％；牛、羊等经济动物的弓形虫感染率达到12％-35％，这给畜牧业带来巨大的经济损失；同时，世界上约有三分之一的人口也有弓形虫感染，给食品安全和人类健康埋下了重大隐患。
2、弓形虫可作为食源性和水源性病原体，是一种机会致病性寄生虫。感染弓形虫可导致弓形虫病，其呈世界性分布，是一种严重影响公共卫生健康和畜牧业经济的寄生虫病。人类弓形虫病可引起发热、咳嗽或呼吸困难等呼吸系统症状；厌食、腹泻等肠胃系统症状以及通过血脑屏障诱发神经症等。该病常呈隐形感染、临床症状非特异性表现，故难以进行准确的临床诊断。目前，尚无针对弓形虫病治疗效果显著的疫苗和药物，且弓形虫病的治疗药物有较强的毒副作用，对于孕妇等特殊人群无有效治疗方法。因此，对弓形虫病的早期诊断和预防至关重要。
3、目前，弓形虫的常用检测方法主要包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测。其中最经典的检测方法是病原学检测，但其存在灵敏度度低、耗时长、工作量大以及对检测人员技术要求高等缺点。弓形虫病临床诊断主要依赖免疫学诊断，该诊断方法虽然具有操作简单和特异性高的特点，但仍存在灵敏度低的缺点，无法对弓形虫早期感染进行及时检测。分子检测技术具有特异性强、灵敏度高的优点，但是具有耗时长、操作复杂、依赖大型仪器等弊端，在一些基层的实验室或现场难以进行。因此，开发出特异性强、灵敏度高，方便快捷的检测方法对ehdv的监控和预防具有重要意义。
4、crispr-cas系统是近年来新开发的一种新型核酸检测技术，在病原体检测方面得到广泛应用。其利用特异性crrna与靶标结合时，激活cas蛋白的旁侧切割活性，无区别地切割周围的dna或rna，包括靶标和报告基团。报告基团被切断后发出荧光，并在此过程中进行至少104倍信号放大，从而实现靶标识别到荧光变化的信号转换。相对于其他基于pcr的检测技术，基于crispr/cas12的核酸检测技术具有方便快捷、成本低廉、且无需昂贵设备和专业人员的优点，具有开发成现场检测工具的潜力。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本发明提供一种仪器依赖性小、操作快速简单、灵敏度高且特异性好的用于弓形虫现场快速检测的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，通过rpa与crispr技术结合，并筛选优化检测用的rpa引物及crrna(crispr rna)序列以进一步提高检测弓形虫的灵敏度。
2、本发明首先提供一种用于弓形虫检测的crrna序列，其检测效果优异、灵敏度高且特异性好，具体地，所述特异性检测弓形虫的crrna序列为seq id no.7,seq id no.11,seqid no.17,seq id no.18,seq id no.21,seq id no.23,或者seq id no.30；或者与之相差不超过2个碱基的核苷酸序列。
3、优选地，该crrna序列与seq id no.7,seq id no.11,seq id no.17,seq idno.18,seq id no.21,seq id no.23,或者seq id no.30相差1个碱基。
4、本发明第二方面提供一种用于弓形虫核酸检测的rpa引物对，其扩增效率高且特异性好，该rpa引物对包含上游引物rpa-f和下游引物rpa-r，所述rpa引物对为:seq idno.36/seq id no.39；seq id no.36/seq id no.42；seq id no.46/seq id no.51；seq idno.46/seq id no.53；seq id no.46/seq id no.54；seq id no.55/seq id no.56；seq idno.55/seq id no.58；或seq id no.55/seq id no.59，
5、或者与之相差不超过2个碱基的核苷酸序列对。
6、本发明第三方面提供一种用于弓形虫核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括rpa-crispr/cas12a系统，所述rpa-crispr/cas12a系统包含如上所述的crrna序列，和/或如上所述的rpa引物对。
7、进一步的，所述试剂盒还包括cas12a蛋白以及具有荧光信号标记的单链dna。
8、进一步的，所述试剂盒还包括a buffer和b buffer。
9、进一步的，所述单链dna为ssdna fq-labeled reporter，具体序列为：5′-fam-ttatt-bhq-3′。
10、进一步的，所述rpa-crispr/cas12a系统还包括rpa扩增体系和crispr/cas12a检测体系所需的其他试剂。
11、进一步的，所述试剂盒中的所有成分在一个反应容器中进行反应。
12、本发明第四方面提供一种用于非诊断目的的弓形虫核酸快速检测的方法，所述方法基于rpa-crispr/cas12a检测系统，通过设计的高特异性、高效率和高灵敏度的优质crrna，和高特异性、高扩增效率的rpa引物保证了弓形虫核酸检测效果，具体地，该方法使用如上所述的试剂盒来执行。
13、进一步的，所述方法包括恒温扩增反应，所述反应的温度为37℃。
14、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
15、(1)本发明提供一种用于弓形虫检测的crrna和rpa引物对，其中crrna具有良好特异性，rpa引物对具有高扩增效率，均与检测的灵敏度和准确度直接相关。本发明还对crrna和rpa引物进行了联合筛选，进一步提高了本发明方法的灵敏度和准确度，最低可以检出10拷贝的靶标dna，与其他寄生虫如弓首蛔虫、犬新孢子虫等不存在交叉反应，有利于弓形虫早期感染的快速检测以及预防。
16、(2)本发明还提供一种用于弓形虫检测的基于rpa-crispr/cas12a系统的一管法检测技术，所有成分在一个反应容器中完成检测反应，减少了液体转移的步骤，降低了气溶胶污染的风险。
17、(3)本发明的检测方法成本低，不需专业规范的实验室，无需使用昂贵的仪器设备(荧光定量pcr仪等)，只需要水浴锅或恒温培养箱和荧光检测仪即可，适合一线使用，降低了检测成本。
18、(4)本发明的检测方法检测时间短，在恒温扩增的同时，crispr-cas12a发挥切割活性，检测荧光变化，仅需30-60分钟便可完成检测。
1.一种用于弓形虫核酸检测的crrna序列，所述crrna序列为seq id no.7,seq idno.11,seq id no.17,seq id no.18,seq id no.21,seq id no.23,或者seq id no.30；或者与之相差不超过2个碱基的核苷酸序列。
2.一种用于弓形虫核酸检测的rpa引物对，所述rpa引物对包含上游引物rpa-f和下游引物rpa-r，所述rpa引物对为:seq id no.36/seq id no.39；seq id no.36/seq idno.42；seq id no.46/seq id no.51；seq id no.46/seq id no.53；seq id no.46/seq idno.54；seq id no.55/seq id no.56；seq id no.55/seq id no.58；或seq id no.55/seqid no.59，
3.一种用于弓形虫核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的crrna序列，和/或如权利要求2所述的rpa引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas12a蛋白以及具有荧光信号标记的单链dna。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括a buffer和b buffer。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述具有荧光信号标记的单链dna为5′-fam-ttatt-bhq-3′。
7.如权利要求3-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的所有成分在一个反应容器中进行反应。
8.一种用于非诊断目的的弓形虫检测方法，使用如权利要求3-7中任一项所述的试剂盒来执行。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括恒温扩增反应，所述反应的温度为37℃。
