本发明涉及高频消融，特别是指一种高频不可逆电穿孔消融技术通过改变参数实现高效的细胞杀伤效果的方法。
背景技术：
1、高频不可逆电穿孔(high-frequency irreversible electroporation，h-fire)作为一种治疗房颤(atrial fibrillation，af)疾病的新型消融技术，目前正受到广泛关注。相比于不可逆电穿孔(irreversible electroporation，ire)，其具有一些优点。首先，它减少了肌肉收缩，并最大限度地减少了气泡的形成。其次，它确保了脉冲电场的更均匀分布，从而导致更彻底的消融。目前，临床试验已经验证了该技术的安全性和有效性。
2、在对脉冲电场的研究过程中，脉冲参数是影响消融最重要的因素之一，不同脉冲参数组合会对细胞产生不同的杀伤效果。h-fire有几个可修改的脉冲参数，如脉冲宽度、电压幅度、脉冲数、脉冲频率、相间延迟和脉冲间延迟。许多研究已经探索了不同脉冲参数的生物效应、消融效应和潜在机制。例如，研究结果表明相比长脉冲宽度的ire，在治疗过程中施加脉冲宽度为2μs的h-fire可以有效减少肌肉收缩的产生。miklovcic等人研究了h-fire中脉冲宽度、脉冲数对组织模型消融的影响，结果显示更长的脉冲能够产生更显著的消融效果；此外当脉冲宽度、电压等保持不变时，施加40-200个脉冲串消融面积并不会显著增加，这表明脉冲数量存在饱和效应。sano等人通过施加双极性脉冲电场对细胞进行实验，结果发现对于较短脉冲宽度的脉冲，其需要施加更高的电场强度才能达到与ire相同的杀伤效果。dong等人通过动物模型探究了h-fire脉冲中电场强度对组织的影响，研究发现随着电场强度的增加，观察到的组织损伤明显增加。
3、尽管h-fire参数相关的生物效应已有广泛研究，并且这些研究成果对其应用起到重要的指导作用，但对于脉冲电场消融而言，如何确定优化的脉冲参数，仍是一个非常具有挑战性的任务。相比于脉冲宽度、电压和脉冲数等其他参数，间期延迟和脉冲间延迟组合对心肌细胞杀伤的确切影响尚不清楚。通过研究相间延迟和脉冲间延迟，结果可为脉冲电场治疗中h-fire参数的优化设计提供一些参考。
技术实现思路
1、本发明提出一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，在脉冲参数研究范围内，增加h-fire中的相间延迟和/或脉冲间延迟可以产生更强的细胞杀伤。
2、本发明的技术方案是这样实现的：一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，包括以下步骤：
3、(1)设定h-fire的脉冲参数，脉冲参数包括h-fire中的相间延迟和脉冲间延迟，选用的脉冲参数在心肌细胞的不应期时间范围之内；
4、(2)取细胞悬浮液于电击杯中，根据步骤(1)设定的脉冲参数，进行脉冲电场处理。
5、进一步地，步骤(1)中，设定的脉冲参数包括：相间延迟0.2-10μs、脉冲间延迟1-500μs。
6、进一步地，步骤(1)中，设定的脉冲参数还包括：脉冲宽度2μs、脉冲数50×4个、频率15hz、电极间距1mm、电场强度3kv/cm-6kv/cm。
7、进一步地，电击杯使用前进行清洗，清洗方法如下：电击杯中注入无菌纯水进行冲洗，重复2次吸干，注入75％酒精冲洗2次或浸泡片刻吸干；
8、对电击杯进行紫外消毒杀菌，注入无菌纯水冲洗3次后吸干，电击杯放置于超净台上，保持超净台吹风以辅助电击杯干燥。
9、进一步地，电击杯使用后进行清洗，去除电击杯中残留的细胞溶液，清洗方法如下：用无菌纯水将电击杯冲洗3次，后面1～2次可以用吸管慢吹；向电极杯中加入适量的75％酒精浸泡5min以上；
10、吸去酒精，用纯水冲洗2次；将电击杯超声清洗30s，随后再次用纯水清洗，最后将电击杯置于超净台中风干。
11、进一步地，步骤(2)中，取100μl细胞悬浮液包含约2×105个细胞于1mm的电击杯中。
12、本发明的有益效果：
13、本发明在脉冲参数研究范围内，增加h-fire中的相间延迟和/或脉冲间延迟可以产生更强的细胞杀伤。但当脉冲间延迟达到100μs及以上时，杀伤效果继续增强，但相间延迟的改变不会影响脉冲电场对细胞的杀伤效果。此外，细胞膜损伤检测发现，短期高细胞膜通透性不一定会导致低细胞存活率，细胞死亡受多种因素的影响。细胞凋亡检测发现，不同高频脉冲电场处理后细胞存在两种死亡方式，即早期发生细胞坏死、晚期发生细胞凋亡。在对其他因素的研究中，研究发现不同高频脉冲电场处理后，ca2+浓度、线粒体膜电位等均发生了变化，这表明ca2+、线粒体等在细胞死亡中也发挥着重要作用。此外，研究发现改变相间延迟和脉冲间延迟引起的实验现象与焦耳热引起的热效应相关性较低。
1.一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，步骤(1)中，设定的脉冲参数包括：相间延迟0.2-10μs、脉冲间延迟1-500μs。
3.根据权利要求2所述的一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，步骤(1)中，设定的脉冲参数还包括：脉冲宽度2μs、脉冲数50×4个、频率15hz、电极间距1mm、电场强度3kv/cm-6kv/cm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，电击杯使用前进行清洗，清洗方法如下：电击杯中注入无菌纯水进行冲洗，重复2次吸干，注入75％酒精冲洗2次或浸泡片刻吸干；
5.根据权利要求1-3任一项所述的一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，电击杯使用后进行清洗，去除电击杯中残留的细胞溶液，清洗方法如下：用无菌纯水将电击杯冲洗3次，后面1～2次可以用吸管慢吹；向电极杯中加入适量的75％酒精浸泡5min以上；
6.根据权利要求1所述的一种高频不可逆电穿孔脉冲参数提升心肌细胞杀伤的方法，其特征在于，步骤(2)中，取100μl细胞悬浮液包含约2×105个细胞于1mm的电击杯中。
