本发明涉及酶工程，更具体地说，它涉及一种细胞色素p450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用。
背景技术：
1、手性叔醇是一类重要的化合物，广泛存在于多种药物和生物活性天然产物中，同时它们也是合成中的多功能砌块。许多化学家和医药工作者报道了其合成方法策略，通常通过外消旋叔醇的动力学拆分和对酮的不对称亲核加成来制备手性叔醇。此外，还可以通过仲醇的直接升级来合成。然而，所有这些方法都需要在相应的c-h键上进行预氧化以形成醇或酮前体。因此，对于目标c-h键没有预氧官能团化的底物，直接进行c-h羟基化是构建手性叔醇的理想且直接的策略。c-h键非常常见，其键能高且极性小，这些因素使得c-h键具备很强的惰性。在温和条件下断裂c-h键是有机合成中最具挑战性的一类反应，因此这种手性叔醇的合成方法尚未得到充分发展。近年来，高度选择性的酶促羟基化在这一领域中显示出前景，成为一个有希望的解决方案。
2、生物催化剂通常具有高度的化学、区域和立体选择性，能够在温和条件下进行无毒催化反应。氧化酶和还原酶在不对称催化中表现出色，能够生成伯醇和仲醇。然而，由于叔醇的叔碳结构，酮还原酶无法合成手性叔醇。具有优异c-h键羟化性能的p450酶则提供了一种可行的手性叔醇合成方案。细胞色素p450单加氧酶(p450)是一种含血红素的酶超家族，在生物体内次生代谢物的生物合成或外源性物质的代谢中发挥重要作用。p450通常作为单加氧酶，在常压下利用分子氧作为更环保的氧化剂，并在催化过程中表现出惊人的区域和立体选择性。p450酶是研究最广泛的加氧酶，已有报道显示p450酶可催化超过40种不同类型的反应。
3、目前，关于p450酶合成叔醇的文献主要限于一些具有单一结构底物的天然产物基因合成簇，如25-羟基维生素d3和mycinamicinv，而外消旋叔碳底物的羟基化未被广泛研究。要实现这种反应，需要克服叔碳的三个非氢原子基团引起的空间位阻效应，并实现外消旋底物内的单结构动力学拆分。张入月等人报道了使用p450pl2及其突变体通过c-h羟化反应合成手性叔醇的方法。然而，该方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶活力低和产物浓度不高等问题，不适合工业化生产手性叔醇。
4、因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素p450单加氧酶，以满足工业化生产手性叔醇的需求具有非常重要的意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种细胞色素p450单加氧酶及其在合成手性叔醇中的应用，以解决现有技术中生物催化制备手性叔醇的反应中，酶活力偏低、步骤繁琐和产物浓度不够高等问题。
2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种细胞色素p450单加氧酶，所述细胞色素p450单加氧酶的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、本发明的另一目的是提供一种如上述的细胞色素p450单加氧酶在合成手性叔醇中的应用，具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素p450单加氧酶的催化下，催化外消旋底物形成手性的叔醇。
4、进一步地，所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液。
5、进一步地，所述外消旋底物的浓度为1～50mmol/l。
6、进一步地，所述细胞色素p450单加氧酶的用量为1～5ku/l。
7、进一步地，所述的细胞色素p450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素p450单加氧酶的重组整细胞、粗酶液或冻干细胞。
8、本发明的又一目的是提供一种含有上述细胞色素p450单加氧酶的蛋白重组菌细胞。
9、本发明的还一目的是提供一种携带编码上述细胞色素p450单加氧酶的基因的载体。
10、本发明的再一目的是提供一种表达上述细胞色素p450单加氧酶的重组菌。
11、通过采用上述技术方案，本发明通过采用本发明提供的技术方案，细胞色素p450单加氧酶作为催化剂，反应的收率最高可达到45％，意味着在反应过程中大部分底物能被成功转化为目标产物，产物的光学纯度最高可达到99％ee(对映体过量)，这表明产物中几乎全为一种手性形式，具有极高的立体选择性，对手性药物和其他手性化合物的制备尤为重要；
12、本发明的反应不仅具有高立体选择性，还具有优异的区位选择性，确保反应发生在目标位置而不是产生副产物，这对于复杂分子的合成尤为重要，本发明的底物浓度高，这意味着可以在较高浓度下进行反应，提高了反应效率，减少了溶剂的使用量，降低了成本；本发明的反应条件温和，这不仅有助于保护底物和产物的结构完整性，还降低了能耗，提高了反应的安全性和可操作性；
13、本发明的催化过程对环境友好，不产生有害副产物，符合绿色化学的原则，有助于减少环境污染，并且操作简便，反应体系易于控制和调节，适合大规模工业生产，减少了对复杂设备和操作的需求，使得本发明所述的细胞色素p450单加氧酶及其基因具有广泛的工业应用前景，可以用于制备高附加值的手性化合物，如药物中间体、农药及其他精细化学品，由于其高效、安全、环保的特点，该技术有望在工业界得到广泛推广和应用。
14、综上所述，本发明具有以下有益效果：
15、1.本发明提供的细胞色素p450单加氧酶在外消旋叔碳底物制备手性叔醇的应用中，表现出优异的催化效率，反应的收率最高可达45％，高收率意味着在相同反应条件下，可以获得更多的目标产物，从而提高生产效率，降低生产成本；本发明的产物的光学纯度最高可达99％ee，说明本发明的催化体系具有极高的立体选择性，高光学纯度的手性叔醇在医药和精细化工领域具有重要应用，能够显著提高产物的纯度并降低副产物；
16、2.本发明反应过程中表现出良好的立体和区位选择性，确保了产物结构的单一性和纯度，高选择性减少了副产物的生成，简化了后续的分离纯化步骤；本发明的反应条件温和，条件易于控制，适合工业化生产，且对设备和操作人员要求较低，有利于大规模应用推广；
17、3.本发明提供的细胞色素p450单加氧酶可以以重组整细胞、粗酶液或冻干细胞的形式添加，操作简便，易于储存和运输，降低了生产过程中的复杂性和成本；本发明所述的细胞色素p450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景，能够显著提高手性叔醇的工业化生产水平。
1.一种细胞色素p450单加氧酶，其特征是：所述细胞色素p450单加氧酶的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.如权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶在合成手性叔醇中的应用，其特征是：具体包括：在缓冲液中，在所述细胞色素p450单加氧酶的催化下，催化外消旋底物形成手性的叔醇。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述的缓冲液为磷酸盐浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述外消旋底物的浓度为1～50mmol/l。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述细胞色素p450单加氧酶的用量为1～5ku/l。
6.根据权利要求2所述应用，其特征是：所述的细胞色素p450单加氧酶的添加形式为含有细胞色素p450单加氧酶的重组整细胞、粗酶液或冻干细胞。
7.一种含有权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶的蛋白重组菌细胞。
8.一种携带如权利要求1所述的编码细胞色素p450单加氧酶的基因的载体。
9.一种表达如权利要求1所述的细胞色素p450单加氧酶的重组菌。
