本发明属于生物，具体涉及一种用于提高霉酚酸产量的优化培养基及其应用。
背景技术：
1、胞内抗生素是一类由微生物细胞内部合成并积累的抗菌物质，广泛应用于医药和农业领域。然而，由于生物合成途径复杂、生产成本高昂及产量不足等问题，限制了其在工业规模生产上的应用。传统的培养基往往不能充分满足生产菌株的生长需求和抗生素的高产表达，因此，优化培养基成分对于提高胞内抗生素的产量具有重要意义。作为胞内抗生素的霉酚酸(mpa)具有抗真菌、抗肿瘤及免疫抑制的作用，其次对黄嘌呤单核苷酸脱氢酶具有可逆性抑制作用，并对淋巴细胞活性起选择性抑制作用。霉酚酸的酯化衍生物霉酚酸酯(mmf)作为新一代免疫抑制剂被广泛应用于器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中，是世界上应用最广泛的免疫抑制剂之一，市场前景良好需求巨大。所以mpa作为mmf的前体化合物，提高mpa的效价对社会和企业都有着重要意义。
2、中国专利申请cn102321697b公开了后期补加利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，公开了发酵培养基包含如下浓度的组分：葡萄糖(c6h12o6·h2o)80～120g/l、甘氨酸12～15g/l、磷酸二氢钾2～4g/l、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5～1g/l、甲硫氨酸0.5～1g/l，溶剂为蒸馏水，ph值为4.4～4.8，最终效价达5.0g/l。中国专利申请cn 112980902 a公开了一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法，公开了发酵培养基包含如下组分：葡萄糖200～250g/l，氨基乙酸10～25g/l，硫酸二氢钾6～10g/l，甲硫氨酸1.0～2.0g/l，微量元素1g/l，泡敌0.3g/l，发酵ph4.5的发酵培养基发酵培养8天，霉酚酸产量达9.2g/l。
3、上面的方法虽然提高了霉酚酸的效价但是技术繁琐不适用于工业上大规模生产，并且效价偏低或者发酵时间长，为了满足社会和工厂的需求就需要寻求一种能快速提高霉酚酸效价的技术和发酵方法。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种优化胞内抗生素生产的培养基，该培养基能够在低甲硫氨酸含量下显著提高短密青霉细胞代谢中产生的霉酚酸含量，从而提升霉酚酸产率，同时降低生产成本。
2、本发明提供一种用于提高胞内抗生素产量的优化培养基在提高霉酚酸效价发酵中的应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，包括甲硫氨酸、碳源、氮源和磷源，在培养中的含量为甲硫氨酸0.3-0.5g/l，碳源180-230g/l，氮源19-27g/l、磷源3-5g/l。
4、其中，所述用于提高胞内抗生素产量的优化培养基为提高霉酚酸生产的优化发酵培养基。
5、其中，所述氮源包括氨基乙酸、酵母提取物、玉米浆粉、大豆糖蜜和酵母细胞壁；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖或者可溶性淀粉。
6、其中，所述酵母提取物为yp600安琪酵母粉、啤酒酵母粉、fm885促生长酵母粉、oxoid酵母提取物中的任意一种。
7、优选采用oxoid酵母提取物。
8、其中，碳源优选采用葡萄糖。
9、其中，所述培养基中还包括微量元素。
10、其中，所述培养基的成分为：葡萄糖180-230g/l，氨基乙酸10-15g/l，磷酸二氢钾3-5g/l，甲硫氨酸0.3-0.5g/l，酵母提取物7-8g/l，玉米浆粉1-2g/l，大豆糖蜜0.5-1g/l，酵母细胞壁0.5-1g/l，微量元素1-2g/l，发酵ph为4.4-4.7。
11、作为优选，所述优化培养基为一种提高霉酚酸产率的培养基，包括葡萄糖180-230g/l，氨基乙酸10-15g/l，甲硫氨酸0.3-0.5g/l，酵母提取物7-8g/l，玉米浆粉1-2g/l，大豆糖蜜0.5-1g/l，酵母细胞壁0.5-1g/l，磷酸二氢钾3-5g/l，微量元素1-2g/l。微量元素中：七水硫酸亚铁、无水合硫酸铜、硫酸锰、七水合硫酸锌质量比为0.020-0.022：0.2-0.3：0.1-0.12：2.0。
12、作为优选，所述微量元素中：七水硫酸亚铁、无水合硫酸铜、硫酸锰、七水合硫酸锌质量比为0.022：0.3：0.12：2.0。
13、进一步地，所述提高霉酚酸产率的培养基的制备方法是按以下步骤进行：
14、(1)称取葡萄糖19g溶于水中定容到70ml为a瓶，加入100ul的配置成溶液的微量元素；
15、(2)称取氨基乙酸1.2g、甲硫氨酸0.04g、磷酸二氢钾0.3g、oxoid酵母提取物0.75g、玉米浆粉0.1g、大豆糖蜜0.1g、酵母细胞壁0.05g、溶于水中定容到30ml为b瓶，ph调整到4.5，高压灭菌锅115℃高压灭菌20min。a与b混合得到100ml的培养基，即为提高霉酚酸产率的优化培养基。
16、本发明所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基在发酵短密青霉菌生产霉酚酸中的应用。
17、其中，所述发酵短密青霉菌生产霉酚酸包括种子培养阶段和发酵培养阶段；所述短密青霉菌为cctcc cf 2008508。
18、其中，所述种子培养阶段包含如下步骤：取短密青霉菌孢悬液斜面培养8-10天，然后生理盐水制备成菌悬液，接着按2-3％接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中，24-26℃、220-260rpm振荡培养26-28h，得到摇瓶种子培养液。
19、其中，所述发酵培养阶段包含如下步骤：将种子培养液按体积比5-10％的接种量接种至含有优化培养基的发酵摇瓶中进行发酵培养，培养温度为24-26℃，220-260rpm，发酵周期为6-7天。
20、作为优选，所述利用上述优化培养基进行胞内抗生素生产的方法，包括以下步骤：
21、a)配制所述的种子培养基和优化的发酵培养基；
22、b)接种生产菌株至种子培养基中，控制接种量为2％(体积比)；
23、c)再从种子培养基中接到优化的发酵培养基中，接种量为10％(体积比)；
24、d)在适宜的温度(24℃)和搅拌条件下(250rpm)进行发酵培养；
25、e)达到稳定期后收获培养液，提取胞内抗生素。
26、本发明用于提高胞内抗生素产量的优化培养基及其发酵方法是为了提高短密青霉菌代谢物中霉酚酸的含量，从而提高霉酚酸的产率。本发明的培养基由葡萄糖、氨基乙酸、甲硫氨酸、oxoid酵母提取物、玉米浆粉、大豆糖蜜、酵母细胞壁、磷酸二氢钾、微量元素和水制成。本发明的方法为：一、制备提高短密青霉菌中霉酚酸的培养基；二、按照发酵方法培养短密青霉菌。利用本发明制备的优化培养基及发酵方法明显提高了短密青霉菌生产霉酚酸的效价；利用本发明制备的培养基，能提高短密青霉菌中霉菌产霉酚酸的活力。
27、本发明在葡萄糖，氨基乙酸，低浓度的甲硫氨酸培养基的基础上进行优化，在氮源上进行了补充，额外加入一定浓度的oxoid酵母提取物、玉米浆粉和大豆糖蜜、酵母细胞壁使得在发酵前期生物量增多，与一般培养基相比氮源种类更丰富，可以让菌在前期发酵中大量繁殖，从而快速获得大量的霉酚酸。
28、实际上，氨基乙酸作为主要氮源在发酵中的量已经达到了最优值，再增加氨基乙酸也达不到增加效价的效果，同时增加甲硫氨酸含量反而会显著降低发酵效果，本发明额外加入新的特定氮源增加了生物量使得效价增多，优化了氮源比一般培养基的氮源更丰富，促使短密青霉菌前期产生更多的生物量，同时发酵更加迅速并有效降低甲硫氨酸的使用量。本发明在原有基础上补充特定的氮源，优化氮源以及配比，找到一种能增加胞内抗生素效价的氮源，从各种酵母粉中筛选出一种能提高效价的oxoid酵母提取物。
29、本发明中培养基中的氮源非常重要，其中酵母提取物与玉米浆粉、大豆糖蜜、酵母细胞壁的配合使用，在生产抗生素霉酚酸起到非常重要的作用。进一步地，氮源中的酵母粉的选择也非常重要，本发明中效果最好的就是oxoid酵母提取物，可以显著提高抗生素霉酚酸的产量，而且其他酵母粉的添加几乎没有作用甚至会起到抑制作用。本发明所需要的胞内抗生素属于短密青霉菌的次级代谢产物，通过增加氮源加快细胞代谢生产出更多的胞内抗生素。本发明培养基成分相对简单，提高了效价；发酵条件优化，发酵时间有效缩短。本发明在优选的配方下可以实现发酵6.5天，即可获得9.7g/l的霉酚酸。
30、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
31、(1)通过优化的配方，提高了培养基的养分利用率和抗生素霉酚酸的生产强度；
32、(2)前期有充足的氮源，加快细胞代谢，不需要后期补料，效价也可以达到相对高的水平。
33、(2)培养基成分较为简单，发酵时间也明显缩短了，降低了生产成本。
34、(3)适用于胞内抗生素的生产菌株，具有较好的普适性和应用前景。
35、综上，本发明优化后的培养基能显著提升微生物或细胞培养的产量和质量，通过对组分的精确配比，可以最大化地合成目的产物霉酚酸。本发明可以筛选出对细胞生长产量影响最大的关键组分，从而进行针对性的优化。这种优化能够针对特定的代谢途径，提高目的产物的合成水平。优化后的培养基可以减少生产成本并提高经济效益。通过合理配置培养基的组分，不仅可以减少昂贵试剂的使用，还可以通过提高产量来降低单位产品的成本。本发明培养基的优化还可以增强生物制造过程的可扩展性。合理的培养基设计有助于从实验室规模顺利过渡到工业生产规模，保持产物的稳定性和一致性。例如，通过逐步优化培养基，可以实现高密度从而提高生物反应器的效率和产量。优化后的培养基还可以提高生产过程的可预测性和重复性。综上所述，优化后的培养基不仅在提升产量和质量上具有明显优势，还在经济和技术创新方面表现出色，为现代生物制药和科研提供了坚实的基础。
1.一种用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，包括甲硫氨酸、碳源、氮源和磷源，在培养中的含量为甲硫氨酸0.3-0.5g/l，碳源180-230g/l，氮源19-27g/l、磷源3-5g/l。
2.根据权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，所述用于提高胞内抗生素产量的优化培养基优选为提高霉酚酸生产的优化发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，所述氮源包括氨基乙酸、酵母提取物、玉米浆粉大豆糖蜜和酵母细胞壁；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖或者可溶性淀粉。
4.根据权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，所述酵母提取物为yp600安琪酵母粉、啤酒酵母粉、fm885促生长酵母粉、oxoid酵母提取物中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，所述酵母提取物为oxoid酵母提取物。
6.根据权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基，其特征在于，所述培养基的成分为：葡萄糖180-230g/l，氨基乙酸10-15g/l，磷酸二氢钾3-5g/l，甲硫氨酸0.3-0.5g/l，酵母提取物7-8g/l，玉米浆粉1-2g/l，大豆糖蜜0.5-1g/l、酵母细胞壁0.5-1g/l，微量元素1g/l，发酵ph为4.4-4.7；其中：微量元素中：七水硫酸亚铁、无水合硫酸铜、硫酸锰、七水合硫酸锌质量比为0.020-0.022：0.2-0.3：0.10-0.12：2.0。
7.一种权利要求1所述的用于提高胞内抗生素产量的优化培养基在发酵短密青霉菌生产霉酚酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵短密青霉菌生产霉酚酸包括种子培养阶段和发酵培养阶段；所述短密青霉菌为cctcc cf 2008508
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述种子培养阶段包含如下步骤：取短密青霉菌孢悬液斜面培养8-10天，然后生理盐水制备成菌悬液，接着按2-3％接孢量接种至装有种子培养基的摇瓶中，24-26℃、220-260rpm振荡培养26-28h，得到摇瓶种子培养液。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养阶段包含如下步骤：将种子培养液按体积比5-10％的接种量接种至含有优化培养基的发酵摇瓶中进行发酵培养，培养温度为24-26℃，220-260rpm，发酵周期为6-7天。
