本发明涉及天然产物生物合成，具体是指一种链霉菌高产萜类底盘的搭建以及基于该底盘菌株用于不同种萜类化合物的高效生产。
背景技术：
1、萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界中广泛存在，迄今为止，人们从动物、植物以及微生物体内发现的萜类化合物超过12万种。该类化合物具有许多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及医药行业。萜类化合物主要由天然产物提取、化学合成、微生物发酵等方法。天然产物提取主要是通过对特定的植物进行萃取纯化分离获得对应的萜类化合物，然而这种生产方式受气候、品种、地理位置、成熟度等诸多不可控因素影响，具有明显的季节性，含量不稳定性，并且大面积种植、养殖的成本较高，含量通常也比较低。另外，在含有多种成分的萃取物中纯化分离特定的萜类化合物在技术上非常困难，这些共同造成了许多具有良好生理活性的化合物价格昂贵。化学合成法受到合成过程中步数众多，合成难度较大，且存在污染等特点，其产品的质量、安全性及使用范围都受到了限制。微生物发酵法主要是利用微生物的生物代谢，将基础代谢物如葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉等廉价原料转化为对应的萜类化合物，这种方法不受季节、地域、气候等因素的影响，原料易获取、生产周期短、工艺操作简单、成本低廉、产物质量可控、产物易纯化、安全性高，并且环境污染较少，不仅解决了因种植植物等而占用大量耕地的问题，也解决了化学合成不环保的弊端。最重要的是，发酵法生产的萜类化合物属于天然型产品，其活性与天然植物提取的活性成分一致，被认为是萜类化合物生产最有前景的方法。本发明以萜类产物为研究目标，以白色链霉菌(streptomyces albus)为异源表达宿主，打造了高产萜类的白色链霉菌底盘，建立了一个提高萜类天然产物产量的放线菌萜类高产底盘，提供了一个用链霉菌生产萜类化合物的方法。
2、目前研究较多的萜类化合物产生菌的主要是酵母菌、大肠杆菌。但是酵母菌属于真核生物，培养条件和基因操作相较于细菌来说较为复杂，且在发酵过程中，会伴有其他物质产生。而大肠杆菌因为自身调控体系过于简单，次级代谢产物产生能力差，实现萜类化合物的大量生产难度较大，且存在噬菌体污染，且对于异源物质的抵抗能力差，从而造成了生产萜类的难度加大。
技术实现思路
1、针对现有技术不足，本发明提供一种高产萜类的微生物底盘细胞，具体地是涉及了高产萜类的链霉菌底盘改造及具有抗炎活性的倍半萜化合物红没药醇和二萜穿心莲内酯合成前体半日花烷骨架，以及贝壳杉烷和阿替生烷骨架的高效合成。
2、为此，本发明的另一个目的在于提出了一种微生物底盘细胞，该微生物底盘细胞生产萜类化合物的产量高，生产周期短，生产效率高。
3、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
4、在本发明的第一方面，本发明提供一种微生物底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物前体能力的基因，所述基因为链霉菌来源的mep途径的基因；所述基因来源于streptomyces.s.1813的1813m1,1813m2,1813m3基因，1813m1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；1813m2基因的核苷酸序列如seq id no:2所示；1813m3基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
5、作为本发明的一种优选，所述的微生物底盘细胞为真核细胞或原核细胞；优选地，所述微生物为链霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌；再优选地，所述微生物为白色链霉菌、阿维链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌；更优选地，所述微生物为白色链霉菌。
6、作为本发明的一种优选，所述萜类化合物选自倍半萜类化合物、二萜类化合物。
7、在本发明的第二方面，本发明提供一种基因片段的用途，所述基因片段由来源于streptomyces.s.1813的1813m1,1813m2,1813m3基因顺次连接组成，所述基因片段用于提高底盘细胞生产萜类化合物前体的用途。
8、本发明所述的微生物底盘细胞通过以下步骤开发：
9、步骤1):建立微生物底盘菌株启动子库:筛选不同来源的启动子，通过调控引入基因的表达，表征最佳表达系统；
10、步骤2):以链霉菌来源的mep途径为参照，通过序列同源性比对分析，从streptomyces.s.1813的基因组数据库中筛选出其本源的mep途径合成酶基因1813m1,1813m2,1813m3
11、步骤3):将步骤2)中筛选的来源streptomyces.s.1813的mep途径的关键3个途径合成酶在步骤1)表征不同强度启动子的调控下，分别构建到不同质粒上，获得所述底盘细胞。
12、故，本发明所述的微生物底盘细胞的制备方法，包括采用接合转移策略，将来源于streptomyces.s.1813的1813m1,1813m2,1813m3基因，整合到白色链霉菌基因组任何位点，获得所述微生物底盘细胞。
13、在本发明的第三方面，本发明提供一种更高产倍半萜前体的微生物菌株，以本发明所述的微生物底盘细胞为出发菌株，选择性的过表达来源于大肠杆菌中的聚异戊烯基合酶基因ispa或来源于白色链霉菌中的聚异戊烯基合酶基因ptlb即得到更高产倍半萜的前体微生物菌株。优选地，基因ptlb的核苷酸序列如seq id no:4所示；基因ispa的核苷酸序列如seq id no:5所示，
14、在本发明的第四方面，一种更高产二萜前体的微生物菌株，以本发明所述的微生物底盘细胞为出发菌株，过表达来源于streptomyces.s.1813聚异戊烯基合酶基因1813t4，即得到更高产二萜前体的微生物菌株。优选地，基因1813t4的核苷酸序列如seq id no:7所示。
15、在本发明的第五方面，本发明提供一种更高产倍半萜(红没药醇)的微生物菌株，以本发明第三方面所述的更高产倍半萜前体的微生物菌株为出发菌株,过表达来源于经链霉菌密码子优化的来源于柠檬链霉菌中的红没药醇合酶基因(mctc1)，即得到更高产倍半萜的微生物菌株。柠檬链霉菌来源的红没药醇合酶基因的核苷酸序列如seq id no:6所示,。
16、在本发明的第六方面，本发明提供一种高产二萜类的微生物菌株，以本发明第四方面所述的更高产二萜前体的微生物菌株为出发菌株,分别组合表达来源于streptomyces.s.1813二萜合酶基因1813t2(seq id no:8)、1813t1(seq id no:11)、bjks(seq id no:10)和细胞色素p450酶基因1813o2(seq id no:9)，即得到所述高产二萜类的微生物菌株。
17、在本发明的第七方面，本发明提出了一种获得微生物生产过程中产生的萜类化合物粗品的方法。根据本发明实施例，所述方法包括:将前面所述的微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述萜类化合物粗品。利用根据本发明实施例的获得微生物生产的萜类化合物，能够尽可能高效率的全部获得。
18、根据本发明的实施例，上述获得微生物萜类化合物粗品的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
19、根据本发明的实施例，利用根据本发明实施例的获得微生物萜类化合物粗品的方法，获取效率高。
20、根据本发明的实施例，所述发酵处理是通过如下方式实现的：将所述微生物进行基础发酵处理，所述基础发酵处理是在基本发酵培养基中进行的，所述基本发酵培养基分别为所述a培养基:可溶性淀粉20g/l,葡萄糖10g/l,蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l,nacl4g/l,k2hpo40.5 g/l,mgso4·7h2o 0.5g/l,caco32 g/l,ph＝7.0。
21、所述b培养基:糊精40g/l，蕃茄膏7.5g/l，水解酪素2.5g/l，酵母提取物5g/l,ph＝7.0。所述d培养基:葡萄糖20g/l，可溶性淀粉60g/l,大豆粉15g/l,酵母提取物5g/l,麦芽提取物5g/l,碳酸钙2g/l,nacl 2g/l,ph＝7.2。
22、所述e培养基:酵母提取物4g/l，麦芽提取物10g/l,葡萄糖10g/l，ph＝7.2。
23、所述f培养基:蔗糖20g/l,葡萄糖10g/l,酪蛋白氨基酸0.1g/l,酵母提取物5g/l,mops 5g/l,k2so40.25 g/l,mgcl·6h2o 1g/l,微量元素盐溶液：10ml/l,ph＝7.2。微量元素盐溶液：zncl240 mg/l,fecl3·6h2o 200mg/l,cucl210 mg/l,mncl2·4h2o 10mg/l,na2b4o7·10h2o 10mg/l,(nh4)6mo7o24·4h2o 10mg/l。
24、所述g培养基:葡萄糖31g/l,大豆粉22g/l,k2hpo4·3h2o 1.6g/l,ph＝7.2。
25、所述gye培养基:葡萄糖15g/l,酵母提取物5g/l，cacl2·2h2o 0.2g/l,ph＝7.2。
26、所述xtm培养基:酵母提取物10g/l,麦芽提取物10g/l,麦芽糖10g/l,微量元素盐溶液：10ml/l,ph＝7.2。
27、所述ptmm培养基:糊精40g/l，乳糖40g/l，酵母提取物5g/l,mops20g/l，微量元素盐溶液：10ml/l,ph＝7.3。
28、所述ms培养基:黄豆粉20g/l，甘露醇20g/l，caco33 g/l,ph＝7.2。
29、根据本发明的实施例，所述萃取处理包括：将所述发酵处理产物进行离心，超声破碎处理及有机萃取处理。发明人对发酵产物进行萃取处理过程中发现，将发酵处理后产物进行离心后分别将上清和菌体分开处理能够降低萃取过程中的乳化现象，并且能够尽可能完全的获得相应产物。
30、在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述微生物在高产萜类化合物中的用途。
31、有益效果：
32、本发明基于接合转移技术介导的特定位点的基因同源重组，在基因组中基因任何位点整合型过表达mep途径关键限速酶基因，建立了高产萜类的链霉菌底盘细胞，实现了倍半萜，二萜的高效生产系统的建立。利用本发明实施例的微生物，生产红没药醇、18-羧基半日花酸、阿替生酸、贝壳杉烯的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。
1.一种产萜类化合物的微生物底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞含有链霉菌stremptomyces.s.1813中来源的mep途径基因模块的1813m1基因、1813m2基因和1813m3基因；1813m1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；1813m2基因的核苷酸序列如seq id no:2所示；1813m3基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
2.根据权利要求1所述的微生物底盘细胞，其特征在于，所述的微生物为真核细胞或原核细胞；优选地，所述微生物为链霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌；进一步优选地，所述微生物为白色链霉菌、阿维链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌；更优选地，所述微生物为白色链霉菌。
3.根据权利要求1所述的微生物底盘细胞，其特征在于，所述萜类化合物选自倍半萜类化合物、二萜类化合物和多萜类化合物中的一种或多种。
4.一种权利要求1或2所述的微生物底盘细胞的制备方法，其特征在于，包括采用接合转移策略，将来源于streptomyces.s.1813的1813m1，1813m2和1813m3基因，分别接合转移到白色链霉菌基因组任何位点，获得所述微生物底盘细胞。
5.一种更高产倍半萜前体的微生物菌株，其特征在于，以权利要求1或2所述的微生物底盘细胞为出发菌株，选择性的过表达来源于大肠杆菌中的聚异戊烯基合酶基因ispa或来源于白色链霉菌中的聚异戊烯基合酶基因ptlb，优选的为过表达来源于大肠杆菌中的聚异戊烯基合酶基因ispa即得到更高产倍半萜前体的微生物菌株。所述来源于白色链霉菌中的聚异戊烯基合酶基因ptlb如seq id n0:4所示，来源于大肠杆菌中的聚异戊烯基合酶基因ispa如seq id n0:3所示。
6.一种更高产二萜前体的微生物菌株，其特征在于，以权利要求1或2所述的微生物底盘细胞为出发菌株，过表达来源于streptomyces.s.1813聚异戊烯基合酶基因1813t4，即得到更高产二萜前体的微生物菌株。所述的来源于streptomyces.s.1813聚异戊烯基合酶基因1813t4序列如seq id no:7所示。
7.一种高产倍半萜化合物的微生物菌株，其特征在于，以权利要求5所述的微生物底盘菌株为出发菌株，过表达来源于柠檬链霉菌经密码子优化的红没药醇合酶基因mctc1，得到高产倍半萜化合物的微生物菌株；所述的来源于柠檬链霉菌经密码子优化的红没药醇合酶基因mctc1序列如seq id no:6所示。
8.一种高产二萜化合物的微生物菌株，其特征在于，以权利要求6所述的微生物底盘菌株为出发菌株，共表达来源于streptomyces.s.1813二萜合酶基因1813t2和细胞色素p450酶基因1813o2，bjks，1813t1等，即得到所述高产二萜类的微生物菌株；所述的来源于streptomyces.s.1813基因1813t2序列如seq id no:8所示，基因1813o2序列如seq id no:9所示，基因1813t1序列如seq id no:11所示，来源于大豆根瘤菌中的基因bjks序列如seqid no:10所示。
9.一种获得萜类化合物粗品的方法，其特征在于，包括:将权利要求7～8任一项所述的微生物菌株进行发酵处理，将发酵处理产物进行萃取处理，以获得所述萜类化合物粗品；所述发酵处理优选通过如下方法实现的：所述发酵是分别在不同的基础培养基中进行的，其中，所述几种不同的基本培养基分别为a培养基、b培养基、d培养基、e培养基、f培养基、g培养基、gye培养基、xtm培养基、ptmm培养基、ms培养基：
10.来自streptomyces.s.1813的1813m1，1813m2和1813m3基因在构建高产萜类化合物的微生物底盘细胞中的应用。
