本发明属于生物医学工程，特别涉及一种细胞球模块化生物墨水制备方法及其在心肌梗死治疗领域应用。
背景技术：
1、干细胞移植已被证明是一种很有前景的治疗损伤器官/组织的方法，如心肌组织梗死，或复杂疾病，包括糖尿病和骨关节炎。心肌细胞不可逆死亡引起的心肌梗死(mi)可损害心肌功能，导致心力衰竭。干细胞移植具有自我再生、免疫调节作用和营养作用，如血管生成、抗纤维化和抗凋亡，已被证明是心肌梗死后缩小梗死面积和恢复心功能的一种很有前景的治疗方法。然而，心肌梗死后，病理微环境的初始阶段是由缺氧缺血诱导的高水平蛋白酶和活性氧(ros)，这不仅导致局部心脏细胞和移植干细胞的细胞活力大幅下降，而且减少了细胞的植入，从而影响了治疗效果。此外，心肌细胞的创伤会引发严重的炎症反应，导致单核细胞的募集，单核细胞可以在梗死部位分化为巨噬细胞。由于初始巨噬细胞(m0型)可以在环境提示下向促炎m1或抗炎m2巨噬细胞极化，危险的心肌梗死微环境通常会导致一系列严重的炎症反应，最终导致心力衰竭。这也会对周围的健康细胞或移植的治疗细胞产生有害的毒性作用。因此，在心肌梗死部位纠正这种严重的炎症微环境，并触发巨噬细胞向有利于愈合的m2表型极化，可能会促进损伤心脏组织的愈合。基于此，基于干细胞移植的免疫调节治疗可以纠正巨噬细胞极化，从而启动级联反应，将促炎微环境逆转为促愈合微环境，这被认为是心肌梗死治疗的一种很有前景的策略。具体来说，为了使干细胞治疗能够重塑心肌梗死的促炎微环境(如缺氧、高水平ros、蛋白酶和炎症因子的过度产生等)，需要在治疗过程中对各种生物事件进行精确的协调和管理，然而，这仍然是心肌修复领域的一个挑战。
2、由于(同种异体)干细胞直接移植治疗心肌梗死面临着由于宿主免疫清除和不良病理微环境导致的低愈合效果，研究者努力克服这些障碍，以提高干细胞治疗心肌修复的疗效。考虑到心肌梗死早期以缺氧缺血、氧化应激和炎症期为特征，研究者提出了用缺氧/化学条件或基因重编程预处理干细胞以提高细胞存活率和/或功能的策略。此外，有研究表明，与传统的二维(2d)结构细胞移植相比，三维(3d)结构干细胞或细胞球体移植更有效地治疗心肌梗死。因为在缺氧条件下保留细胞活力，并增强组织修复营养分泌的作用。尽管取得了这些进展，但在改善预处理对细胞的作用时间、提供对外部应激的保护以及屏蔽异体细胞免受免疫清除方面仍存在挑战。因此，人们努力将细胞包裹在生物材料中，如多糖或蛋白质，以产生承载细胞的凝胶或贴片，作为抵抗外部应激和宿主免疫系统的保护层。不幸的是，大多数包封策略只能在介导供体-宿主反应中提供单一功能，而未能认识到操纵周围环境生态位的重要性，因此在治疗效果方面表现出不足。因此，同时改善供体细胞功能和逆转不良病理微环境的创新方法被认为是进一步应用于心肌梗死治疗的更有前景的策略。
3、本发明提出了一种细胞球模块化生物墨水的制备方法及其在心肌修复治疗领域应用策略，通过在细胞球体上引入蛋白质/多酚复合涂层，并结合颗粒凝胶形成可打印的生物墨水，涂层作为多功能装甲，提供针对宿主免疫系统的免疫保护和免疫调节治疗，以逆转敌对微环境，促进梗死心肌组织的愈合过程。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种细胞球模块化生物墨水的制备方法及其在心肌修复治疗领域应用。
2、本发明通过层层自组装在干细胞球体周围生成蛋白/多酚保护层，其中多酚作为交联剂与蛋白结合，酚类具有清除ros的能力。此外，蛋白和多酚组成的涂层能够改变干细胞分泌的旁分泌因子，通过激活糖酵解，促进血管生成和免疫调节。进一步将具有涂层的干细胞球体与颗粒凝胶相结合，形成剪切变稀，可注射可打印的生物墨水。将其移植到心肌梗死大鼠体内，发现与裸细胞球体治疗相比，通过介导巨噬细胞向促愈合的m2表型极化，明显减轻了局部炎症和随后的纤维化，并改善了梗死心肌组织的心功能。
3、本发明采用如下技术方案来实现。
4、本发明提供了一种具有组织修复功能的细胞球模块化生物墨水，模块化生物墨水由细胞球和颗粒微凝胶组成；所述颗粒凝胶的干重质量分数为0.1-50％，体积分数大于0.5；所述细胞球在球体表面引入一层自组蛋白与多酚涂层；所述颗粒凝胶提供可注射、可打印性能；所述载细胞球的直径为40-1000um。
5、上文所述的技术方案中，进一步地，所述模块化生物墨水中细胞数量为2～10000个，优选为100～3000个。
6、本发明提供了一种具有涂层的干细胞球制备方法，包括以下几个步骤：
7、(1)培养细胞球的pdms多微孔装置的制作
8、微孔pdms装置中间有一个方形容器。方形容器底部有1024个孔。每口厚度为0.6mm的梯形井，上侧面的正方形长度为0.46mm，下侧面正方形长度为0.25mm。采用投影微立体光刻技术制作主模。然后，将主模具嵌入金属铝构件中。将盖板放置在主模具上，用螺丝固定四个角，获得总装配模具。将脱气的pdms预聚液倒在模具上，85℃固化。将固化后的微孔pdms装从装配模具中取下，灭菌、亲水处理。用去离子水和无血清细胞培养基冲洗后，将其用于细胞球培养。
9、(2)将步骤(1)所述的pdms多微孔装置用于细胞球培养。细胞悬液将采用4种不同的细胞密度，获得不同尺寸的球体，并测量每个球体的直径。
10、(3)将步骤(2)所述的细胞球收集，洗涤后。将收集的球体与天然聚合物孵育，然后离心除去上清。将多酚类物质加入包被球体中轻轻混合后分离与上清。天然聚合物层依次与多酚类物质层交替沉积在球体上。
11、(4)将步骤(3)所述的具有涂层的细胞球和微流控制备的颗粒凝胶作为可注射或可打印材料，经密堆积后，利用生物打印的方式实现载生物活性物质的微凝胶的精确排布。
12、上文所述的技术方案中，所述另一种聚合物材料为天然聚合物或合成聚合物的一种或者二种以上的组合，所述天然聚合物包括细胞外基质、海藻酸、海藻酸盐、海藻酸盐衍生物、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖；蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、层连接蛋白。
13、上文所述的技术方案中，具体而言，步骤(3)中所述的被包埋活体细胞是本领域技术人员可以根据实施目的的不同进行选择；
14、所述活体细胞一般为原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种或二种以上的组合；
15、上文所述的技术方案中，利用集成微流控芯片制备微凝胶的过程，主要包括如下步骤：
16、①聚合物溶解于水或pbs或培养基中制备溶液，随后加入交联反应引发剂，得到水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第一相水相溶液，另一相将细胞加入上述溶液中得水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第二相水相溶液；
17、②将含有非离子表面活性剂的矿物油(石蜡/二甲基硅油)作为油包水乳液体系的油相；或含氟化表面活性剂的氟化油，作为油包水乳液体系的油相。
18、上文所述的技术方案中，所述多通道微流控芯片：各通道优先流速及更优选流速为单通道的倍增，例如，两通道微流控芯片为单通道流速的2倍，三通道微流控芯片为单通道的流速的3倍，以此类推。
19、上文所述的技术方案中，具体而言，所述第一相和第二相水相流速总和与第一重油相的流速比为1:0.01～1之间，优选1:0.05～0.5；第一重油相流速和第二重油相流速比为1:0.1～50，优选1:0.5～10。
20、上文所述的技术方案中，所述交联反应引发剂包括①配位反应引发剂(选自钙-乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、钙-氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸钙纳米颗粒、硫酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒中一种或几种的组合)，所述引发剂的终浓度以钙含量记为10-1000mm；②具有良好生物相容性的光化学反应引发剂(选自2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone,i2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate,lap)、偶氮引发剂va086(2,2'-(diazene-1,2-diyl)bis(n-(2-hydroxyethyl)-2-methylpropanamide)、安息香甲基醚(2-methoxy-2-phenyl-acetophenon)、伊红y(eosiny)中一种或几种的组合)，光照波长为365nm-780nm，光照时间0.00001s-600s；③温度介导的交联剂，交联温度为0-40℃；④酶催化反应所用酶(选自歧化酶、凝血酶、谷氨酰胺转氨酶中一种)。
21、上文所述的技术方案中，所述微流控技术制备得到的颗粒凝胶产品直径为20～500μm；粒径分布的离散系数在0.01～20％，
22、上文所述的技术方案中，步骤(4)是将步骤(3)制备的具有涂层的细胞球和微流控制备的颗粒凝胶作为可打印的生物墨水，借助三维(3d)移动平台，通过按需逐点打印和层层叠加的方式，达到精确构建三维复杂结构的目的。
23、上文所述的技术方案中，将所述的用于注射或生物打印的颗粒凝胶是由微流控制备的微凝胶进行密堆积，置于打印容器中，进行生物打印。其中，具有涂层的细胞球和微流控制备的颗粒凝胶密堆积方法可以是离心，过滤，以及抽滤等化工操作单元。
24、上文所述的技术方案中，进一步地，颗粒凝胶的材料包括胞外基质、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖或蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、层连接蛋白；所述颗粒凝胶与细胞球的混合方式，包括对流混合或剪切混合；所述对流混合通过机械搅拌或翻转设备，使颗粒整体移动或翻转，从而实现混合；所述剪切混合，通过施加剪切力，使颗粒在混合过程中相互摩擦和挤压，从而打破颗粒间的团聚现象，达到均匀混合的效果。
25、本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
26、(1)本发明设计了一种基于微芯片的快速制备细胞球模块化生物墨水的新方法，实现细胞球的大量生产，保证了较高的细胞活性。
27、(2)本发明提出了一种基于生物材料涂层设计结合间充质干细胞球体的心肌梗死治疗策略。该生物材料涂层能够调控病理心肌梗死微环境，同时具有多种功能，包括保护供体细胞免受宿主免疫清除；通过清除ros和刺激msc促愈合旁分泌重塑促炎微环境，显着提高了干细胞治疗效果。进一步阐明了该涂层对干细胞影响潜在的治疗机制。
28、(3)本发明可通过生物打印技术将有涂层的干细胞球颗粒凝胶精确排布。其中，有涂层的干细胞球颗粒凝胶可被用作组织构建块，以创建三维(3d)组织和器官，形成单细胞精度、高细胞密度仿生组织微单元。
29、(4)本发明采用技术能够有效保证细胞活性；且利用可注射直接原位递送细胞用于疾病治疗或生物打印方式能够实现三维复杂结构的构建，在再生医学领域具有良好的应用前景。
1.一种具有组织修复功能的细胞球模块化生物墨水，其特征在于，模块化生物墨水由细胞球和颗粒微凝胶组成；所述颗粒凝胶的干重质量分数为0.1-50％，体积分数大于0.5；所述细胞球在球体表面引入一层自组蛋白与多酚涂层；所述颗粒凝胶提供可注射、可打印性能；所述载细胞球的直径为40-1000um。
2.根据权利要求1所述的细胞球模块化生物墨水，其特征在于，所述模块化生物墨水中细胞数量为2～10000个，优选为100～3000个。
3.权利要求1所述的细胞球模块化生物墨水的制备方法，其特征在于，所述细胞球的制备包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的细胞球模块化生物墨水，其特征在于，pdms多微孔装置的制备方法包括：设有一个方形容器，方形容器底部有1024个孔，每口厚度为0.6mm的梯形井，上侧面的正方形长度为0.46mm，下侧面正方形长度为0.25mm；采用投影微立体光刻技术制作主模；将主模具嵌入金属铝构件中；将盖板放置在主模具上固定得总装配模具；将脱气的pdms预聚液倒在模具上，85℃固化；将固化后的微孔pdms装从装配模具中取下，灭菌、亲水处理；用去离子水和无血清细胞培养基冲洗后，将其用于细胞球培养。
5.根据权利要求2所述的细胞球模块化生物墨水，其特征在于，涂层为细胞提供定制化微环境的材料为天然聚合物和/或小分子多酚类物质。
6.根据权利要求5所述的细胞球模块化生物墨水，其特征在于，天然聚合物包括细胞外基质、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖；蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白或层连接蛋白；小分子多酚类物质包括花青素、儿茶素、槲皮素、没食子酸、鞣花酸或熊果苷。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述颗粒凝胶的材料包括胞外基质、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖或蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、层连接蛋白；所述颗粒凝胶与细胞球的混合方式，包括对流混合或剪切混合；所述对流混合通过机械搅拌或翻转设备，使颗粒整体移动或翻转，从而实现混合；所述剪切混合，通过施加剪切力，使颗粒在混合过程中相互摩擦和挤压，从而打破颗粒间的团聚现象，达到均匀混合的效果。
8.权利要求1所述的细胞球模块化生物墨水在制备组织修复材料领域中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的组织修复为急性心肌梗死的心肌损伤修复。
