本发明属于生物医用材料中的组织修复领域，涉及一种梯度矿化的胶原纤维膜，本发明还包括其制备方法和应用。
背景技术：
1、附着点是肌腱和骨骼连接的组织，其复杂的梯度形貌结构、化学组成与理化特性对肌腱－骨生理功能的执行至关重要。近年来，随着全民健身运动的大力推广，肌腱－骨损伤的发生率呈上升趋势。天然的肌腱－骨界面由分层纤维软骨组成的过渡组织构成，确保肌腱与骨骼之间的牢固连接，并有效地传递应力；根据与骨表面的接近程度由低至高，肌腱－骨界面分为肌腱纤维区、未矿化纤维软骨区、矿化纤维软骨区和骨骼区。肌腱损伤在临床上非常普遍，肌腱－骨界面的重建是治疗过程中的关键环节。然而，康复周期长、应变依赖性瘢痕形成以及血管形成不良等问题导致术后恢复自然肌腱－骨(附着点组织)仍然面临巨大挑战。
2、基于生物学手段的促进肌腱－骨界面再生的策略主要包括将生物活性材料、合适的种子细胞或干细胞、生长因子和基因递送等应用于重建的界面。然而，迄今为止，这些替代方案中很少有提供成功的长期解决方案。传统的肌腱植入材料，如基于聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的韧带增强和重建系统和gore-tex，虽然具有优异的机械性能，但却存在缺乏生物活性的问题，无法促进适当的新组织生长和与宿主组织的有效整合，从而导致肌腱－骨界面愈合效果不佳，甚至出现并发症。此外，尽管同种异体移植物和自体移植物保留了天然肌腱的结构和成分，以及生物活性分子，但供体部位发病率、不良免疫应答和滑膜炎等负面影响限制了其临床应用。
3、目前的肌腱替代品有以下常见问题：
4、a.大多数肌腱替代品不能发挥良好的生物活性：由不可降解聚合物制成的人工韧带，如基于聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的韧带增强和重建系统虽然具有优异的机械性能，但是缺乏令人满意的生物活性，无法实现新组织向内生长并与宿主组织良好整合，导致肌腱－骨界面愈合不良，甚至出现滑膜炎和长期植入物失效等并发症。
5、b.开发具有相似异质过渡区域的局限：单相支架的结构和组成均匀，通常不可能完全重建软组织和硬组织及其界面。双相支架具有两相层状结构，每一层的成分、内部结构和机械性能通常不同，可以同时满足软骨和软骨下骨植入和修复的要求，但双相支架在受损肌腱－骨界面上的整合力较差，力学稳定性较弱，不利于缺损的修复。在多相支架设计中，支架被隔离成三层或多层，层之间表现出突然过渡的性质，重建功能性天然附着点仍具挑战性。
6、c.传统的保守治疗或手术修复主要侧重于重建附着点解剖学结构，而忽略了附着点组织再生：传统手术治疗主要是利用断裂的肌腱末端来重建附着点：首先将断裂的肌腱直接插入骨隧道，然后使用缝合线或螺钉对重建组织进行机械锚定，并最大限度地减少外部载荷，以避免手术后意外松动或再次撕裂。然而，重建的附着点可能会在很长一段时间内保持与骨骼的弱连接，导致断裂处形成疤痕组织而不是所需的健康附着点组织，其缺乏肌腱和骨骼之间复杂过渡的重构，因此传统的保守治疗或手术修复在肌腱－骨损伤修复方面的疗效有限。
7、因此，迫切需要一种新型肌腱替代品，具有优异的生物相容性、生物活性和力学性能，能够促进天然肌腱－骨界面的再生。仿生天然肌腱－骨界面的生物材料可为受损界面组织再生提供有利的环境，并诱导损伤处原位再生附着点组织。胶原蛋白是人体肌腱细胞外基质(ecm)的主要成分，具有优异的生物相容性和生物活性。模拟肌腱生理ecm的排列有序的胶原纤维材料被认为是肌腱组织工程的理想材料。为了确保肌腱－骨界面支架具有高度仿生性，需要精心设计附着点支架的内部结构。考虑到肌腱－骨界面的结构、机械性能、化学性质和细胞表型的梯度特征，设计具有结构、机械性能和生化梯度的仿生材料有助于促进腱－骨界面的再生。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是提供一种具有梯度矿化层的肌腱修复材料，以更好模拟天然肌腱－骨连接结构，促进肌腱-骨界面愈合。
2、本发明提供了一种梯度矿化的(高取向)胶原纤维膜，包括梯度矿化层与未矿化层。
3、所述梯度矿化层包括ⅰ型胶原蛋白组分和空间梯度分布的hap(羟基磷灰石)组分，
4、所述未矿化层由ⅰ型胶原蛋白组分组成。
5、优选地，所述的ⅰ型胶原蛋白组分具有高度取向的纤维结构，纤维结构的herman取向因子分布在0.92-0.99。
6、一般来说，由于矿化，所述梯度矿化层的厚度、宽度略大于所述未矿化层的厚度、宽度，但厚度、宽度之差可忽略不计。优选地，所述梯度矿化层的宽度可以是所述未矿化层宽度的1-1.5倍，所述梯度矿化层的厚度可以是所述未矿化层厚度的1-1.5倍。较好的，所述梯度矿化层的宽度与厚度相同。
7、优选地，所述梯度矿化层与所述未矿化层的长度比为(1-9)：(1-9)，更选为(7-8)：(2-3)。
8、另一方面，本发明提供了上述梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法。将胶原纤维膜沿着纤维取向方向竖直于容器底部放置，然后以0.3-0.7ml/h的速度将矿物质溶液连续注入容器中，在35℃-39℃恒温条件下矿化，矿化完成后去除表面多余的矿化液，然后使其在35℃-39℃恒温条件干燥。
9、优选地，将高取向胶原纤维膜竖直于容器底部放置后，以0.5-0.6ml/h的速度将矿物质溶液连续注入容器中。然后，进行恒温矿化和/或干燥，温度优选为36℃-38℃)，更优选地，温度设定为37℃。
10、优选地，所述矿物质溶液ph值为7.37-7.49，其包括混合均匀的等体积的溶液a组分和溶液b组分。矿物质溶液ph值优选为7.40-7.42。
11、其中，溶液a组分为0.1m cacl2·2h2o与0.02-0.04g/ml聚天冬氨酸固体粉末的混合溶液；优选地，溶液a组分中聚天冬氨酸固体粉末的含量为0.03-0.04g/ml；更优选地，溶液a组分中聚天冬氨酸固体粉末的含量为0.03g/ml。溶液b组分选自0.1m na2hpo4与0.04-0.08g/ml聚丙烯酸固体粉末的混合溶液或0.1m k2hpo4与0.04-0.08g/ml聚丙烯酸固体粉末的混合溶液中的至少任一种。优选地，溶液b组分中聚丙烯酸固体粉末含量为0.06-0.08g/ml；更优选地，溶液b组分中聚丙烯酸固体粉末含量为0.06g/ml。溶液a组分中聚天冬氨酸固体粉末的含量：溶液b组分中聚丙烯酸固体粉末含量为1：(1.5-2.5)，优选地，为1：2。
12、优选地，所述聚天冬氨酸固体粉末的分子量为10-11kda，所述聚丙烯酸固体粉末的分子量不小于2000da；所述聚天冬氨酸固体粉末与所述聚丙烯酸固体粉末的质量浓度比为1：2。
13、优选地，矿物质溶液选自以下配方中的任意一种：
14、ⅰ：9mm cacl2·2h2o+4.2mm k2hpo4+50μg/ml pasp；
15、ⅱ：10.0mm cacl2·2h2o+6.0mm na2hpo4+90mm nacl+350μg/ml paa+10mm l-glutamic acid；
16、ⅲ：1.67mm cacl2·2h2o+9.5mm na2hpo4+150mm nacl+240μg/ml pasp+sodiumcitrate；
17、ⅳ：sbf+180μg/ml paa+2.5wt％tpp；或者，
18、ⅴ：solution a:0.1m cacl2·2h2o+0.03g/ml pasp；solution b:0.1m na2hpo4+0.06g/ml paa。
19、本发明的实验结果表明，5个配方的矿物质含量依次升高，ii、ⅳ、v配方的hap特征晶体衍射峰显著高于另两组，v配方表现出最强的hap特征晶体衍射峰。
20、本发明中，所述高取向胶原纤维膜的制备方法包括以下步骤：
21、将拉伸至100％—200％应变的胶原凝胶膜浸泡在0.1m pbs溶液中1—4小时(优选2—3小时)，同时向膜的两端连续加载以保持取向结构；
22、浸泡后，将胶原凝胶膜置于nh3气氛中12—36小时(优选24—30小时)，并同时在胶原凝胶膜两端连续施加外力。
23、再一方面，本发明提供了所述的梯度矿化的高取向胶原纤维膜的应用，所述的梯度矿化的高取向胶原纤维膜的在肌腱－骨修复中的应用。
24、优选地，所述的应用包括下列中的一项或者若干项：
25、(1)具有对齐的分层纤维状结构，在对齐方向上增强机械性能：
26、(2)支持与肌腱和骨骼愈合相关的细胞的粘附和持续增殖；
27、(3)允许提供不同的局部理化环境，选择性地促进细胞向肌腱、软骨或骨骼的分化，从而可能重建肌腱与骨骼界面组织的梯度细胞表型；
28、(4)增强愈合损伤部位的机械性能和动物运动功能的恢复。
29、本发明中，ahf-col是指经过拉伸后获得的高取向结构胶原纤维膜。ahf-col在图1之后的图(如图8)中是指电化学组装胶原蛋白凝胶膜e-col经过拉伸200％应变后并通过生理离子溶液浸泡、nh3气氛孵育24小时得到的高取向结构胶原纤维膜。
30、如图1所示，图1中的ahf-cols是指电化学组装胶原蛋白凝胶膜e-col经过拉伸不同应变(50％、100％、150％、200％)后并通过生理离子溶液浸泡、nh3气氛孵育24小时得到的不同程度取向结构胶原纤维膜，rf-col是电化学组装胶原蛋白凝胶膜e-col不拉伸，但通过生理离子溶液浸泡、nh3气氛孵育24小时得到的近似无取向结构胶原纤维膜。ahf-col在图1之后的图(如图8)中是特指电化学组装胶原蛋白凝胶膜e-col经过拉伸200％应变后并通过生理离子溶液浸泡、nh3气氛孵育24小时得到的高取向结构胶原纤维膜。
31、gma-col是指梯度矿化后获得的高取向/梯度矿化胶原纤维膜，是指对ahf-col(200％应变的高取向结构胶原纤维膜)采用矿化方案ⅴ进行梯度矿化后获得的高取向/梯度矿化胶原纤维膜。
32、mahf-col是矿化/高取向胶原纤维膜。mahf-cols是对上述200％应变的高取向结构胶原纤维膜ahf-col进行矿化后获得的高取向/矿化胶原纤维膜(此处矿化方式不是梯度矿化，而是矿化整个ahf-col(200％应变)材料)；加上s是因为探究了五种矿化方案(ⅰ-ⅴ)对于ahf-col的矿化效果，并比较五种矿化方案(ⅰ-ⅴ)的矿化效果(图8c-d、图9)选取最好的矿化方案ⅴ，然后探究了采用矿化方案ⅴ矿化的ahf-col(200％应变)后得到的高取向/矿化胶原纤维膜mahf-col(v)的相关理化性能(图8e-n)。
33、本发明的有益效果如下：
34、(1)ahf-col具有对齐的分层纤维状结构，在对齐方向上表现出增强的机械性能：ahf-col的力学性能随取向程度的提高而显著提高，在200％应变条件下制备的ahf-col在干燥状态下最高的拉伸强度(95.97±1.6mpa)和杨氏模量(5.06±0.07gpa)。(来自不同动物的天然肌腱组织的强度在55到120mpa之间变化)。
35、(2)梯度矿物含量利于机械刚度的空间连续变化：梯度矿物含量对于肌腱到骨骼的自然整合至关重要，为机械刚度的空间连续变化提供了一种机制，从而消除了界面处的高应力，有效地将机械负荷从肌腱传递到骨骼。在植入物中构建矿物质含量梯度不仅可以更好地适应体内从肌腱到骨骼的机械刚度过渡，而且有可能为空间细胞表型提供异质的物理化学线索(例如，刚度、成分)，促进肌腱到骨骼的重建。控制矿化溶液在空间和时间上渗透到支架中，为在ahf-col上产生矿物梯度提供了一种潜在的方法。材料中纤维内和纤维间hap的梯度分布可以模拟骨骼中矿物质的分层空间分布，确保机械性能从相对柔韧的软组织平稳过渡到坚硬的硬组织。
36、(3)gma-col上局部区域的分化表面形态、矿物质含量、刚度和润湿性在一定程度上会影响细胞的粘附、增殖和分化：gma-col的不同区域表现出良好的生物相容性，支持与肌腱和骨骼愈合相关的细胞的粘附和持续增殖。此外，这些结果可能表明，gma-col允许提供不同的局部理化环境，可以在空间上选择性地促进细胞向肌腱、软骨或骨骼的分化，从而可能重建肌腱与骨骼界面组织的梯度细胞表型。
37、(4)gma-col的植入显著增强了愈合损伤部位的机械性能和动物运动功能的恢复：新形成的肌腱组织表现出成熟的胶原表达和组织排列，而重建的附着点组织则形成成熟的纤维软骨，表现出与再生骨组织具有渗透性和紧密的连接。更令人鼓舞的是，这种材料的植入显著增强了愈合损伤部位的机械性能和动物运动功能的恢复。总体而言，这种仿生植入物/贴片材料具有优异的机械性能和梯度生物学功能，显示出从肌腱到骨骼全面再生的巨大潜力。
1.一种梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，将高取向胶原纤维膜沿着纤维取向方向竖直放置于容器底部，然后以0.3-0.7ml/h的速度将矿物质溶液连续注入容器中，在35℃-42℃恒温条件下矿化，矿化完成后去除表面多余的矿化液，然后使其在35℃-42℃恒温条件干燥；
2.根据权利要求1所述的梯度矿化胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，矿物质溶液选自以下配方中的任意一种：
5.根据权利要求1所述的梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，所述胶原纤维膜是高取向胶原纤维膜，高取向胶原纤维膜的制备方法包括：
6.根据权利要求5所述的梯度矿化的胶原纤维膜的制备方法，其特征在于，
7.一种梯度矿化的胶原纤维膜，其特征在于，包括梯度矿化层与未矿化层；
8.根据权利要求7所述的梯度矿化的胶原纤维膜，其特征在于，所述的ⅰ型胶原蛋白组分具有高度取向的纤维结构，纤维结构的herman取向因子分布在0.92-0.99；
9.权利要求7或8所述的梯度矿化的胶原纤维膜的应用，其特征在于，所述的梯度矿化的胶原纤维膜的在肌腱－骨修复中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括下列中的一项或者若干项：
