本发明涉及藤茶中二氢杨梅素增溶，具体为藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺及应用。
背景技术：
1、藤茶是葡萄科蛇葡萄属的木质藤本植物，普遍分布在国内的长江以南区域，藤茶的表面常附着白色样的特殊结晶，味微苦后回甘，被广泛应用且历史悠久，国内的少数民族将其嫩叶加工炮制后作为茶饮，又称霉茶、白茶、甜茶藤、甘露茶等，已被记载于《中草药汇编》、《湖北省中药材质量标准》、《广西药用植物名录》等。
2、藤茶性凉，味微苦涩、回甘淡；具有清热解毒、平肝泻火、消肿利湿、活血、解酒毒和化浊的效果；用于治疗黄疸型肝炎、咽喉肿痛及风热感冒等症，亦具有抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、降脂降糖、保肝及免疫力增强等作用。目前藤茶已被作为一种药食同源类，被大众广泛关注和认可。
3、现代药理学研究发现，藤茶内含有多种化学成分，比如黄酮类化合物、多糖、茶多酚、挥发油及微量元素等。黄酮类化合物的含量是藤茶中占比最多的有效成分，截至目前已从藤茶中分离并鉴定出的黄酮类化合物有共计35种，包含二氢杨梅素、杨梅素、芦丁等物质，其中以二氢杨梅素的含量最多，约占藤茶黄酮总含量的80％。
4、二氢杨梅素别名蛇葡萄素，属于黄酮类化合物中的一种多酚基双氢黄酮醇。二氢杨梅素外观呈白色针状的结晶或者粉末状态，在甲醇、乙醇和丙酮中易溶，乙酸乙酯内微溶，三氯甲烷和石油醚内难溶解。二氢杨梅素的溶解性，分别于低温与常温状态时较差，易溶于热水中(当温度>100℃时将导致不可逆的氧化反应出现)。
5、因为藤茶中二氢杨梅素成分存在水溶性较差以及易氧化的问题，严重影响其在医药和产品开发领域的使用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供了藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺及应用，解决了上述背景技术中提出的问题。
2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，包括二氢杨梅素的提取工艺以及二氢杨梅素的增溶；
3、二氢杨梅素的提取工艺包括藤茶中二氢杨梅素的含量测定、方法学考察、提取溶剂的对比、环糊精种类考察、单因素实验以及响应面优化实验；
4、二氢杨梅素的增溶包括气流粉碎技术对二氢杨梅素的包合与分析、复合物的制备方法、三种复合物的表征测定和复合物的理化性质分析；
5、气流粉碎技术对二氢杨梅素的包合与分析，在上述得到最佳的二氢杨梅素的提取工艺基础上，按二氢杨梅素：环糊精(2：1、1：1、1：2、1：4、1：6)不同的比例称取，用研钵初步混匀，再至气流粉碎机进行粉碎包合，得到包合物粉末；利用液相进行测定，计算不同比例粉末的包合率和载药率，从而完成包合比例的筛选；
6、复合物的制备方法具体如下：
7、(1)利用冷冻干燥技术制备二氢杨梅素的复合物，称取定量的样品和环糊精与乙醇溶液在磁力搅拌器下加热搅拌；经反应后，取出溶液，放冷后滤过；再经旋转蒸发回收30-45％乙醇，溶液置48h冷冻干燥，得复合物粉末；
8、(2)将制备得到的二氢杨梅素和环糊精按比例混合，并在研钵中充分混合5min，制备得到两者的研磨混合物；
9、(3)利用气流粉碎技术将二氢杨梅素和环糊精混合得到两者的包合粉末；
10、复合物的理化性质分析具体如下：
11、(1)溶解性实验，等量称取0.05g的dmy和dmy/m-β-cd研磨混合物、气流和冻干包合物分别加入到含有5ml蒸馏水的试管中；通过在25±1℃下使其全部溶解，使溶液的溶解度达到饱和状态；随后，分别将试管中的溶液用滤膜过滤，续滤液加纯化水溶解，摇匀并定容，稀释到适宜的倍数，按二氢杨梅素的含量测定方法进样测定，即得dmy和三种dmy/m-β-cd复合物的溶解性；
12、(2)稳定性实验，精密称取三份等量的dmy/m-β-cd复合物，分别置于称量瓶中，保证厚度分布均匀；待测样品置于60℃恒温箱内共10天，分别在第5、10天时取样，纯化水溶解分别配制成1mg/ml的溶液，再经滤膜滤过，收集续滤液进样测定，以浓度和外观变化情况为依据，考查其高温稳定性；
13、同上述步骤将三种复合物，分别置于恒温恒湿箱(rh75％±5％)内10天，并分别在第5、10天取样，纯化水溶解后，配制为1mg/ml的溶液，再用滤膜过滤，收集续滤液进样测定，以浓度和外观考查其高湿稳定性；
14、(3)体外抗氧化实验，具体包括abts+自由基清除能力研究和dpph自由基清除能力研究。
15、可选的，所述二氢杨梅素的含量测定的具体步骤如下：
16、(1)色谱条件与系统适用性要求设定，其中色谱柱选择c18填充，c18设为250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比15：85，0-12min；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长290nm；理论板数规定≥5000；检测灵敏度：1aufs；
17、(2)对照品溶液制备，用精密天平称取12.5mg二氢杨梅素至25ml量瓶内，待甲醇全部溶解，定容至刻度，得到0.5mg/ml的对照品溶液；
18、(3)供试品溶液制备，取藤茶粉末0.5±0.001g，其粉末过40目筛，倒入20ml甲醇，超声处理20min，倒出提取液，操作重复一次，用4ml的甲醇洗涤残余物，将提取液合并转移至50ml量瓶内，甲醇进行定容到刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液10ml，再转移至100ml量瓶中，甲醇全部溶解再定容，滤过后，即得到供试品溶液；其测定方法为精密吸取两种溶液5μl，利用色谱仪测定。
19、可选的，所述方法学考察的具体步骤如下：
20、(1)线性关系考察，精密称取20mg二氢杨梅素，转移到10ml量瓶内甲醇稀释，超声辅助使其完全溶解，再定容并摇匀，制备得到2mg/ml储备液；采用二分法稀释，甲醇定容到刻度，分别制成2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml不同浓度的溶液；按二氢杨梅素的含量测定中的色谱条件进样，观察并记录，考查浓度和峰面积两者间的线性关系；
21、(2)精密性实验，按供试品溶液方法制备，依据二氢杨梅素的含量测定中的色谱条件，对同一份溶液反复测定6次，用峰面积值直接反应精密性，计算6次结果的均值和rsd值；
22、(3)稳定性实验，依据二氢杨梅素的含量测定中的色谱条件，对同一份供试品溶液分别在配制后0h、2h、4h、8h、12h、24h各时间节点，根据峰面积值反应出稳定性情况，计算均值和rsd；
23、(4)重复性实验，平行制备6份供试品溶液，根据上述二氢杨梅素的含量测定中的色谱条件测定，考察其重复性和rsd值；
24、(5)回收率实验，精密称取9份0.25g藤茶样品，分别加入含量为0.5mg/ml的对照品溶液2ml、4ml、6ml于10ml容量瓶中各3份，以甲醇稀释至刻度后摇匀，配制成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml的待测溶液，经滤膜过滤后取续滤液，根据上述二氢杨梅素的含量测定中的色谱和进样条件测定，通过计算得到平均回收率。
25、可选的，所述提取溶剂的对比，选择甲醇和乙醇作为溶剂进行提取，同时对比考察热水提取的效果和添加环糊精后的提取率变化；实验拟定提取条件：样品与环糊精1：1混合、超声提取20min、料液比1：40，对比这三种溶剂影响提取率的情况，以及加入环糊精后提取率的提升效果，根据结果和综合分析，确定最终选择的提取溶剂。
26、可选的，所述环糊精种类考察，拟定样品与环糊精1：1混合、提取时间20min、料液比1：20、乙醇浓度50％、温度70℃，研究不同的环糊精种类对二氢杨梅素提取率的影响，其中环糊精种类分别为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、hp-β-环糊精、m-β-环糊精、sbe-β-环糊精；对比不同环糊精的辅助提取效果，确定选择的环糊精种类。
27、可选的，所述单因素实验的具体步骤如下：
28、(1)提取时间对二氢杨梅素复合物提取率的影响，当料液比1：50、提取温度60℃、醇浓度50％的条件时，分析20min、30min、40min、50min、60min各个提取时间的选择对于二氢杨梅素提取率的影响；
29、(2)醇浓度对二氢杨梅素复合物提取率的影响，当料液比1：50、提取50min、温度60℃的条件时，分别分析30％、40％、50％、60％、70％乙醇浓度的不同对于二氢杨梅素提取率的影响；
30、(3)提取温度对二氢杨梅素复合物提取率的影响，当料液比1：50、提取50min、醇浓度50％的条件时，分析提取30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度的差异对于二氢杨梅素提取率的影响；
31、(4)料液比对二氢杨梅素复合物提取率的影响，当提取时间50min，醇浓度50％，温度50℃的条件时，分析1：30、1：40、1：50、1：60、1：70料液比的比例差异对于二氢杨梅素提取率的影响。
32、可选的，所述响应面优化实验，根据乙醇浓度、料液比、提取温度和时间因素对提取率高低的影响并对比，提取时间对提取率的影响小；再结合响应面优化方法和原理，选择料液比、提取温度和乙醇浓度三个因素进行实验设计；利用design-expert.v10.0软件设计响应面试验，设置料液比(a)、提取温度(b)、乙醇浓度(c)为自变量，响应值为二氢杨梅素提取率(y)，制定3因素3水平17个试验点的二次正交设计实验；以二氢杨梅素为响应面，确定最优提取条件。
33、可选的，所述abts+自由基清除能力研究，具体步骤如下：
34、a、取200μl稀释的abts+自由基溶液，加入至50μl不同浓度梯度(7.81μm，15.63μm，31.25μm，62.5μm，125μm)的样品溶液中，将获得的溶液快速摇动30秒，并在黑暗中再放置6分钟；
35、b、通过紫外/可见光谱法测量734nm处的abs，并使用维生素c(vc)做阳性对照；每个样品的清除率，以sa(％)表示；每份样品的50％有效浓度(ic50)由描述样品的sa(％)与浓度推测得到；
36、c、再用等体积的水替代abts的水溶液，分别加入到200μl不同浓度的样品溶液中，经过6min充分反应后，设置734nm的检测波长，并测定反应溶液的吸光值；
37、d、用50μl的纯化水替代浓度不同的样品溶液，再将200μlabts的水溶液加入50μl纯化水中，迅速摇匀混合，室温下充分反应6min，再置于734nm波长下测定反应溶液的吸光度值；
38、所有的样品均需连续测定三次，二氢杨梅素及三种复合物参照abts自由基的等式计算清除率；将得到的三种复合物自由基清除率，分别与二氢杨梅素的计算结果进行比较，论证使用环糊精包合是否对二氢杨梅素本身的抗氧化力有显著增加；
39、dpph自由基清除能力研究，具体步骤如下：
40、a、取100μldpph检测液，加入到浓度不同的100μl二氢杨梅素中，及其三种复合物溶液中，确保充分摇匀混合液，使其30min完全反应；
41、b、采用紫外/可见光谱法测量517nm处的abs，vc作为阳性对照；每个样品的清除率，用sa(％)表示；
42、c、随后用等体积的乙醇替代dpph的醇溶液，依次加入至100μl不同浓度的样品溶液中；经过30min反应时间后，置于517nm检测波长处，测定反应溶液的吸光度值；
43、d、用100μl的纯化水替代不同浓度的样品溶液，随后将100μldpph的乙醇溶液添加至100μl纯化水中，迅速混匀，在室温中进行30min完全反应，置于517nm波长处，测定反应溶液的吸光度；
44、所有的样品均需连续测定三次，根据dpph自由基等式计算出，二氢杨梅素及三种复合物的清除率；将得到的三种包合物自由基清除率，分别与二氢杨梅素算出的结果进行比较，论证使用环糊精包合是否对二氢杨梅素本身的抗氧化力有显著提升。
45、一种利用上述权利要求任一项所述的藤茶中二氢杨梅素的应用，包括基于上述提取的二氢杨梅素，利用冷冻干燥的方法进行包合物的制备，包合物具体为二氢杨梅素泡腾颗粒；
46、二氢杨梅素泡腾颗粒的制备方法具体如下：
47、步骤一：选择50％乙醇1：70料液比60℃加热搅拌，滤过提取液浓缩，备用；
48、步骤二：选择湿法制粒的方法，取二氢杨梅素复合物的浓缩液1ml与酸源混合：混合酸质量分数30％(柠檬酸和酒石酸各15％)、甜味剂(蔗糖)添加量3％、填充剂(10％甘露醇)均匀分成两份、20％碳酸氢钠，分别与酸碱源混匀，过80目筛；
49、步骤三：将润滑剂在70℃水浴加热呈融化状，待熔融状态时，快速倒入酸碱源与引湿剂(2％氯化钠)，并搅拌至聚乙二醇冷却，其中润滑剂为5％聚乙二醇4000。
50、步骤四：将制备的颗粒过筛，湿颗粒充分烘干，再整粒即得。
51、本发明提供了藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺及应用，具备以下有益效果：
52、该藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，选择环糊精辅助提取的工艺方法，实现边提取边包合增溶，节省原料和时间成本，结合响应面的优化方法开展最佳工艺筛选，最终使二氢杨梅素原本的提取率和稳定性实现显著提升；利用气流粉碎技术确定不同包合比例粉末的包合率和载药率，实现边粉碎边包合的目的，进而得到二氢杨梅素包合物；通过结构表征和理化性质研究，判断应用该包合工艺是否对二氢杨梅素起到增溶和提高生物利用度的作用；在此基础上进行二氢杨梅素泡腾颗粒剂的制备，为二氢杨梅素相关产品开发提供新思路和参考价值，具有一定的创新性；
53、环糊精同时兼备外表面的强亲水性，及疏水性的筒状空腔结构，因此常被用于改善被包合药物的水溶性。无毒、高生物降解性是环糊精的优势，因此能被广泛应用于食品、化妆品和药品领域中，环糊精辅助包合提取是一种绿色环保且低成本的新工艺方法，能实现对药物中活性成分的提取和包合，简化工艺流程，且高效省时。当药物与环糊精形成包合物后，能够最大化保留药效成分、增强药物的利用度和稳定性、降低刺激性、减缓释放速度、改善药物的苦涩感、使药物从液体转变为粉末化等功效；
54、该藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，选用hplc完成dmy的含量测定方法分析，在浓度位于0.1-2mg/ml范围内，与峰面积呈线性关系；同时该分析方法有较好的精密度、稳定性、重复性和回收率，可作为dmy含量测定的有效方法；
55、该藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，冷冻干燥法能实现dmy与m-β-cd之间完全包合，呈现可观察的无定形状态；通过理化性质实验对包合物粉末进行分析，其中溶解性实验表明三种复合物在水中的溶解度较二氢杨梅素有明显改善；稳定性实验表明，二氢杨梅素在构成包合状态后，稳定性较之前有明显提高；该实验中用到的表征测定方法，不仅可以进行物质鉴别与检定，还能对包合物具体的作用机制展开深入探索，具有准确、直观、高效的显著优势，能够证明二氢杨梅素是否进入环糊精的空腔，以及两者形成包合物的作用机制。
1.藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于，包括二氢杨梅素的提取工艺以及二氢杨梅素的增溶；
2.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述二氢杨梅素的含量测定的具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述方法学考察的具体步骤如下：
4.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述提取溶剂的对比，选择甲醇和乙醇作为溶剂进行提取，同时对比考察热水提取的效果和添加环糊精后的提取率变化；实验拟定提取条件：样品与环糊精1：1混合、超声提取20min、料液比1：40，对比这三种溶剂影响提取率的情况，以及加入环糊精后提取率的提升效果，根据结果和综合分析，确定最终选择的提取溶剂。
5.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述环糊精种类考察，拟定样品与环糊精1：1混合、提取时间20min、料液比1：20、乙醇浓度50％、温度70℃，研究不同的环糊精种类对二氢杨梅素提取率的影响，其中环糊精种类分别为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、hp-β-环糊精、m-β-环糊精、sbe-β-环糊精；对比不同环糊精的辅助提取效果，确定选择的环糊精种类。
6.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述单因素实验的具体步骤如下：
7.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述响应面优化实验，根据乙醇浓度、料液比、提取温度和时间因素对提取率高低的影响并对比，提取时间对提取率的影响小；再结合响应面优化方法和原理，选择料液比、提取温度和乙醇浓度三个因素进行实验设计；利用design-expert.v10.0软件设计响应面试验，设置料液比(a)、提取温度(b)、乙醇浓度(c)为自变量，响应值为二氢杨梅素提取率(y)，制定3因素3水平17个试验点的二次正交设计实验；以二氢杨梅素为响应面，确定最优提取条件。
8.根据权利要求1所述的藤茶中二氢杨梅素的增溶工艺，其特征在于：所述abts+自由基清除能力研究，具体步骤如下：
9.一种利用上述权利要求1-8任一项所述的藤茶中二氢杨梅素的应用，其特征在于，包括基于上述提取的二氢杨梅素，利用冷冻干燥的方法进行包合物的制备，包合物具体为二氢杨梅素泡腾颗粒；
