本发明涉及基因农业，具体涉及一种与红米直链淀粉含量相关的基因序列片段及红米直链淀粉含量改良方法。
背景技术：
1、水稻是全球最重要的粮食作物，大约有一半以上的人口以水稻为主食。日常食用的白米一般都是精米，在加工过程中损失了80％的营养。红米等有色米富含花青素、不饱和脂肪酸、谷维素、维生素和多种矿物质，有抗氧化、清除自由基、控血糖、抗衰老的功效，是营养价值较高的食品。但红米的食用以糙米为主，食味欠佳，适口性不如平时食用的白米精米，且难以消化，所以很少被当作主食。因此，红米只被当作杂粮，偶尔出现在餐桌上。定向改良红米的直链淀粉含量，提高其适口性，培育好吃又不失营养的红米品种，对于推动红米产业发展具有重要意义。
2、“皮鼓粘”是贵州的优质特色种质资源，收集于贵州省盘州市，其作为盘州红米的一员在2016年被列为国家地理标志产品，其米饭色泽红润，营养物质丰富，具有抗氧化，降血糖等药用作用，为药食两用的稻米之一。但“皮鼓粘”直链淀粉含量较高(20％左右)，另因红米的食用以糙米为主，导致其口感较硬，难以消化，营养品质高但口感差限制了其推广和应用，如何降低“皮鼓粘”的直链淀粉含量并改善其适口性是当下亟待解决的问题。
3、研究表明稻米中淀粉是胚乳的主要组成成分(占干重的90％)，淀粉的含量、组成和结构决定了稻米的软度和适口性，一般来说，低或中等直链淀粉含量的熟米粒具有弹性、粘性和光滑的质地，适口性更好(li h,prakash s,nicholsont m,et al.the importanceofamylose and amylopectin fine structure for textural properties of cookedrice grains.food chemistry,2016,196:702-711.)。wx基因是控制直链淀粉含量的主效基因，该基因编码gbssi酶来催化合成直链淀粉(wang z,wuz l,xing y y,etal.nucleotide sequence of rice waxy gene.nucleic acids research,1990,18(19):5898.)。直链淀粉含量的多样性很大程度上归因于wx位点的等位基因变异，稻米的糯性与非糯性也由wx基因的变异引起。迄今为止，至少有8个wx复等位基因wxlv、wxa、wxin、wxb、wxop、wxhp、wxmq和wx已被证明与水稻品种中五种直链淀粉含量类型相关(zhang c,zhu j,chen s,et al.wxlv,the ancestral allele ofrice waxy gene.molecular plant,2019,12(8):1157-1166.)。不同的wx位点表现出不同的直链淀粉含量和蒸煮品质(lin l,wangy,xu x,et al.relationships between starch molecular components and eating andcooking qualities of rice using single-segment substitution lines withdifferent wx loci.journal ofcereal science,2023,114:103765.)。除了wx外，flo19、beiib、beiia对稻米直链淀粉的调控也有一定作用。
4、对wx基因的编码区进行敲除，会造成wx基因表达完全丧失，稻米直接变成直链淀粉几乎不存在的糯米。因此，如何协调水稻特别是“皮鼓粘”等红米的直链淀粉含量和优良营养品质，精准改良红米“皮鼓粘”等的直链淀粉含量，但是不改变其品质，既是提高水稻食味品质的现实需要，也是农业可持续发展的需要。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供与红米直链淀粉含量相关的基因序列片段及红米直链淀粉含量改良方法，具体是通过以下技术方案得以实现。
2、一种与红米直链淀粉含量相关的基因序列片段，该基因序列片段位于淀粉颗粒型结合酶wx基因的启动子区域起始密码子上游2206-2183bp的区域以及wx基因的起始密码子上游2050-2027bp的区域。其核苷酸序列如seq id no.1所示：
3、seq id no.1：
4、tgtatctggttttgcggttgaaggacggaaattggatttattgacaagtcaagggaccttagatgaacttattcctttttatatttgcacaggcctaatttcaagtccagcccagctttcttcagcctgtttgataattctctctagcttattacagccgtgggagaggagatatacagctacaagattacaagtcgatgtatacagcaaacccatgagctgattgcctgattagacggtaagaatgcatccctgagaagcaaatgcatcaccaaatttgtagcttagataaatgctgtgacctgcaagaaaataaaattaaaatcaaaataaaagaaaagcgcaggtaattgacaccccacgcatataagtgtagatacataacacgttcatctaatcatcttaattagacttaggtaaaactacaatgaggtttatgtcctacggaatgacgacaagctagcagcacagaggcacagatcatatcgtctccagactcaagtgcacgttgatcgttcgctcactgcttcatcgatcatccctttgtcgaggcgttagttggcaggcactaatagctacagtaaagtaaagagcaacgtgccaacgtacgcacgctaacgtgagtcatgtagcgtaattccaagttcttttttttttgtcagcacgtacaagcagccgctagcctcgccctgcatgagaagctcgcggcgcgccaccaaactggcaggcactcagctcgctgctggtcccgcacgtcgccacacgatcgacgtacgcacgcgagcgagatccaccgatggtttacgcgtacgccgacggctcacacatcccccggtgcccaacagaaaccacacaccacccgcacgaaaaaaaccgaaccgcacgtgcgcgcgcgctccacgcacaccccaaacagacggcacggcgggagcgcgcgcgcgcacgcgagccgaggagaaaacaaacgggggaaacaagctggaaaagcaaaaggggaaaagaacggagcggaggcttcacccacggccaccgcgacgcgccaccagcgtgcggtgcaatgcaacgtacgccaagccgaaacggcaggcagcatcgcgcacgcacgcacacacaggccacagcacacgcgagcgacgtacgcgagtgcatgcagatgcatgcgcggggctcgcgcgagaccggccgatgggttcgcttctcttctctctcccgtcccgttgcgtcgtcatagacaaaagtcggttttgcttttggttttttggctctgaggcactgacgtgcgggccagcgtacgcctgcgtgccccgcatgtcatcgtcgacaccggccggggaccgggtaaaatgtgttgcgggagggagagggggagagagagatcgcgcgggcttcacgcaacggcgctacaaatagccacccacaccaccaccccctctctcaccattccttcagttctttgtctatctcaagacacaaataactgcagtctctctctctctctctctctctctctctctctctctgcttcacttctctgcttgtgttgttctgttgttcatcaggaagaacatctgcaagttatacatatatgtttataattctttgtttcccctcttattcagatcgatcacatgcatctttcattgctcgtttttccttacaagtagtctcatacatgctaatttctgtaaggtgttgggctggaaattaattaattaattaattgacttgccaagatccatatatatgtcctgatattaaatcttcgttcgttatgtttggttaggctgatcaatgttattctagagtctagagaaacacacccaggggttttccaactagctccacaagatggtgggctagctgacctagatttgaagtctcactccttataattattttatattagatcattttctaatattcgtgtctttttttattctagagtctagatcttgtgttcaactctcgttaaatcatgtctctcgccactggagaaacagatcaggagggtttattttgggtataggtcaaagctaagattgaaattcacaaatagtaaaatcagaatccaaccaattttagtagccgagttggtcaaaggaaaatgtatatagctagatttattgttttggcaaaaaaaaatctgaatatgcaaaatacttgtatatctttgtattaagaagatgaaaataagtagcagaaaattaaaaaatggattatatttcctgggctaaaagaattgttgatttggcacaattaaattcagtgtcaaggttttgtgcaagaattcagtgtgaaggaatagattctcttcaaaacaatttaatcattcatctgatctgctcaaagctctgtgcatctccgggtgcaacggccaggatatttattgtgcagtaaaaaaatgtcatatcccctagccacccaagaaactgctccttaagtccttataagcacatatggcattgtaatatatatgtttgagttttagcgacaatttttttaaaaacttttggtcctttttatgaacgttttaagtttcactgtctttttttttcgaattttaaatgtagcttcaaattctaatccccaatccaaattgtaataaacttcaattctcctaattaacatcttaattcatttatttgaaaaccagttcaaattcttttaggctcaccaaaccttaaacaattcaattcagtgcagagatcttccacagcaacagctagacaaccacc。
5、该基因序列片段，包含2034-2033bp中间插入或不插入a的ct区域。
6、所述的基因序列片段，在水稻改良及育种方面的应用。
7、进一步的，所述水稻改良及育种方面，具体是抑制或者敲除所述基因序列片段，可以有效降低稻米直链淀粉含量；过表达所述基因序列片段，可以有效提高稻米直链淀粉含量。
8、所述的基因序列片段的编辑方法，包括如下步骤：
9、采用crispr/cas9系统，其sgrna的靶序列位于所述启动子区域中，且靶序列的3’端连接的序列为ngg；靶序列的长度为19-20bp，n为a、t、g、c中的任意一个核苷酸。基因组编辑具体可借助crispr/cas9系统实现。所述crispr/cas9方法，其靶序列为位于wx基因中任一包括xxxngg的核苷酸序列上的xxx序列。在所述启动子区域中设计crispr/cas9系统的sgrna的靶序列，可以有效保证目的基因的表达量适度降低。
10、进一步的，所述靶序列位于wx基因的起始密码子上游2206-2183bp的区域以及wx基因的起始密码子上游2050-2027bp的区域，经基因编辑后，可获得突变型水稻植株，所述突变型水稻植株上的一个或者两个所述靶序列发生突变。
11、进一步的，所述sgrna为sgrna1和sgrna2；所述sgrna1的靶序列如seq id no.4所示，所述sgrna2的靶序列如seq id no.5所示：
12、seq id no.4：target 1：5’-catcgatcatccctttgtcgagg-3’(seq id no.4，如seqid no.1上与wx基因起始密码子atg距离2206—2183bp的区段所示，pam为agg)；
13、seq id no.5：target 2：5’-cgccctgcatgagaagctcgcgg-3’(seq id no.5，如seqid no.1上与wx基因起始密码子atg距离2050-2027bp的区段所示，pam为cgg)。
14、一种精确改良红米直链淀粉含量的方法，通过抑制或者敲除所述基因序列片段来进行。
15、进一步的，所述抑制或者敲除所述基因序列片段，是采用上述编辑方法进行敲除，经基因编辑后，获得突变型红米植株，所述红米植株上的一个或者两个所述靶序列发生突变。
16、最终经过基因编辑得到的红米为满足如下条件的植株：wx基因的启动子区域碱基序列在一个或者两个sgrna的靶点区域发生突变。经过基因改造的红米理解为不仅包含第一代到第二代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中遗传该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
17、一种创制直链淀粉含量较好的水稻新种质的方法，通过抑制或者敲除目标水稻中的上述基因序列片段即可。
18、本技术所述的基因编辑试剂/方法均可以用于抑制wx基因的表达，和/或用于降低wx蛋白的丰度，和/或用于敲除wx基因，并用于水稻分子育种中；经所述试剂处理后获得突变植株，所述突变植株中wx-1材料中wx基因相对表达量比野生型皮鼓粘显著的下降到了0.3左右，而wx-2，wx-3材料中的wx基因相对表达量比野生型皮鼓粘未出现明显的下降。
19、与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
20、本技术发明人研究发现wx基因启动子序列是影响稻米直链淀粉含量、并导致适口性的基因关键位点，不同的wx基因位点会导致不同的直链淀粉含量。本发明利用基因编辑技术在“皮鼓粘”中对颗粒结合型淀粉合酶wx基因启动子序列多个区段进行了敲除，发现其atg上游一个特殊区段敲除后，wx基因表达适度下降，“皮鼓粘”直链淀粉含量从20％下降到5％左右，胶稠度从61mm提高到99mm左右。本发明可以应用于水稻直链淀粉的精确调控和贵州地方优质稻的分子育种实践中。本发明提供了通过适度降低wx基因的表达降低直链淀粉含量的方法。本发明的具体实施例证明通过编辑wx基因的启动子序列，可实现精确改良贵州地方优质稻“皮鼓粘”的直链淀粉含量，改良水稻品质，方便该品种的推广种植，便于优质种质资源的保存。
1.一种与红米直链淀粉含量相关的基因序列片段，其特征在于，该基因序列片段位于淀粉颗粒型结合酶wx基因的启动子区域起始密码子上游2206-2183bp的区域以及wx基因的起始密码子上游2050-2027bp的区域。
2.如权利要求1所述的基因序列片段，其特征在于，其包含2034-2033bp中间插入或不插入a的ct区域。
3.权利要求1所述的基因序列片段，在水稻改良及育种方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻改良及育种方面，具体是抑制或者敲除权利要求1所述基因序列片段，可以有效降低稻米直链淀粉含量；过表达权利要求1所述基因序列片段，可以有效提高稻米直链淀粉含量。
5.权利要求1所述的基因序列片段的编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.如权利要求5所述的编辑方法，其特征在于，所述靶序列位于wx基因的起始密码子上游2206-2183bp的区域以及wx基因的起始密码子上游2050-2027bp的区域。
7.如权利要求5所述的编辑方法，其特征在于，所述sgrna为sgrna1和sgrna2；所述sgrna1的靶序列如seq id no.4所示，所述sgrna2的靶序列如seq id no.5所示：
8.一种精确改良红米直链淀粉含量的方法，其特征在于，抑制或者敲除权利要求1所述基因序列片段。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抑制或者敲除权利要求1所述基因序列片段，是采用权利要求5所述方法进行敲除，经基因编辑后，获得突变型红米植株，所述红米植株上的一个或者两个所述靶序列发生突变。
