本发明属于蛋白质组学，尤其涉及一种一步法处理极微量组织样品的方法。
背景技术：
1、蛋白质组学研究中样本前处理过程是及其重要的一步，在质谱分析之前需要将不同类型的样本经过蛋白裂解，还原烷基化，蛋白酶酶解，脱盐从而获得具备上机采集的肽段样本。然而，在样本制备的过程中，分多个步骤且通常需要多次转移样本。对于微量样本而言，由于其样本量的限制，常规的制备方法导致样本损耗较多。因此开发出步骤简单且能缩短时长的样本处理技术对微量样本的处理具有重要意义。
2、目前科研人员研发出多种微量样本处理的方法，如fasp(filter-aided samplepreparation)方法通过使用分子量截止(mwco)超过滤装置离心将蛋白质保留在装置中，并在装置中完成酶消化得到满足上机需求的多肽，该方法比较稳定且兼容广泛的裂解液，但在样本量较低时样本的损失较大；sp3(single-pot,solid phase-enhanced sample-preparation)方法利用磁珠表面具有亲水性的羧基或胺基涂层，在有机溶剂的诱导下完成与蛋白质游离的胺基或羧基结合，进一步进行酶消化步骤，sp3方法通过化学结合将蛋白吸附在磁珠上减少样本的损失且适用不同起始量的样本，然sp3方法样本制备过程中由于磁珠的聚集会阻碍高通量实验体系的适应；sisprot(simple and intergrated spintip-based proteomics technology)方法将所有的样本制备集成在一个tip柱上面，缩短了样本制备的时间和损耗，然而该方法需要进行多次的洗脱处理从而获得满足上样条件的多肽样本且无法兼容高盐浓度溶液，实验成本较高；常见的还有ist(in-stagetip digestion)方法与fasp类似，以c18膜作为物理障碍物，阻隔不溶性物质和大分子，通过固相萃取洗脱肽段。
3、以上方法在使用时均需进行蛋白提取的步骤进而进行蛋白处理，得到的多肽需要进一步旋干后复溶，耗时长，操作复杂，在操作中不可避免的造成样本的损失。
技术实现思路
1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种简便、快速的蛋白质组学极微量样本的一步式制备方法。通过在一步内完成微量样本蛋白裂解和酶解的全部前处理过程。前处理的样本完成后酸化和离心后即可直接上样。本发明方法快速而稳定特别适合于为极微量样本的前处理。
2、本发明提供了一种一步法处理极微量组织样品的方法，包括以下步骤：
3、一、准备样本：取微量样本置于的ep管中，根据样本类型进行相应的准备工作；
4、1.1对于新鲜组织样本：向ep管中加入含有蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液，在金属浴4℃震荡，随后离心，弃上清，重复三次；
5、1.2对于ffpe样本：向样本管中加入脱蜡剂脱蜡，使用不同的浓度的醇类梯度复水，弃上清，然后开盖烘干；
6、二、获得肽段：向ep管中加入mix buffer，非接触式超声后孵育，最后加入酸性溶液终止酶切，离心取上清；
7、所述mix buffer由快速胰蛋白酶(rapid trypsin)，caa，tecp，ddm和快速胰蛋白酶缓冲液(rapid trypsin buffer)组成。
8、针对新鲜组织和脱腊处理后的ffpe组织样本，本发明通过优化mix buffer成分调整酶成分，添加还原剂、烷化剂，将裂解-还原-烷基化-酶切所有步骤合并成为一步，步骤简单且成本低，省去了脱盐的多步耗时操作及耗时的旋干操作和复溶操作，进一步减少了样本的损失，大大节约了样本制备的时间。
9、快速胰蛋白酶可以是市售的常用的快速胰蛋白酶。快速胰蛋白酶缓冲液选择与其匹配的，商家推荐的缓冲液即可。
10、在本发明的一个实施方式中，对于新鲜组织样本，所述步骤1.1中，含有蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液的加入量为500μl，在金属浴4℃震荡2min，随后1500g离心3min。
11、在本发明的一个实施方式中，对于ffpe样本，所述步骤1.2包括：
12、1)将ffpe蜡卷切片在65℃孵育60min；
13、2)将孵育后的切片离心至管底；
14、3)加入1ml融蜡试剂，800rpm，37℃，震荡10min；16000rcf，离心3min，弃上清；
15、4)重复2次以上，如2～3次，3～5次等，最后一次把液体吸取干净；
16、5)加入1ml无水乙醇，800rpm，37℃，震荡5min；17000rcf，离心3min，弃上清；
17、6)加入1ml 90％乙醇，800rpm，37℃，震荡5min；17000rcf，离心3min，弃上清；
18、7)加入1ml 75％乙醇，800rpm，37℃，震荡5min；17000rcf，离心3min，弃上清；
19、8)加入200μl水，800rpm，37℃，震荡2min；17000rcf，离心5min，弃上清；
20、9)开盖放入烘箱烘干。
21、在本发明的一个实施方式中，所述步骤二中，所述mix buffer中rapid trypsin浓度为0.02-0.05μg/μl，caa浓度为4mm，tecp浓度为1mm，ddm浓度为0.4％。优选的，所述mixbuffer中rapid trypsin浓度为0.03μg/μl，caa浓度为4mm，tecp浓度为1mm，ddm浓度为0.4％。
22、在本发明的一个实施方式中，所述步骤二中，非接触式超声条件为20s off、20son,超声功率85％，超声时间为5min。
23、在本发明的一个实施方式中，所述步骤二中，孵育条件为70℃，500rpm下孵育1-2h。
24、在本发明的一个实施方式中，所述步骤二中，离心条件为14000g离心10min。
25、在本发明的一个实施方式中，所述步骤二中，酸性溶液为10％fa。
26、在本发明的一个实施方式中，还包括步骤三：上机准备：使用nano drop检测肽段浓度，配制为100ng/μl的符合上机要求的多肽样本。
27、在本发明的一个实施方式中，所述步骤一中微量样本为起始量≤1mg的组织样品，可以是脑、心、肝、肺等各器官的组织样品。
28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29、针对新鲜组织和脱腊处理后的ffpe组织样本，本发明通过优化mix buffer，将裂解-还原-烷基化-酶切所有步骤合并成为一步，步骤简单且成本低，省去了脱盐的多步耗时操作及耗时的旋干操作和复溶操作，进一步减少了样本的损失，大大节约了样本制备的时间(从常规的约24小时缩小到2.5小时)，且达到了较好的蛋白组学测试效果，特别适合于起始量1mg以内的极微量组织样品。
1.一种一步法处理极微量组织样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1.1中，含有蛋白酶抑制剂的pbs缓冲液的加入量为500μl，在金属浴4℃震荡2min，随后1500g离心3min，重复三次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1.2包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mix buffer中快速胰蛋白酶浓度为0.02-0.05μg/μl，caa浓度为4mm，tecp浓度为1mm，ddm浓度为0.4％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，非接触式超声条件为20soff、20s on,超声功率85％，超声时间为5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，孵育条件为70℃，500rpm下孵育1-2h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，离心条件为14000g离心10min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，酸性溶液为10％fa。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤三、上机准备：使用nano drop检测肽段浓度，配制为100ng/μl的符合上机要求的多肽样本。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤一中微量样本为起始量≤1mg的组织样品。
