本发明涉及一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法和包括该制造方法的药物组合物的制造方法，以及将核酸导入细胞内或靶细胞内的方法，所述包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法包括在制备不含核酸的脂质纳米粒子后加入核酸的步骤。
背景技术：
1、为了将使用sirna等寡核酸的核酸治疗、使用mrna或pdna等的基因治疗投入实际应用，需要有效且安全的核酸递送载体。病毒载体是高表达效率的核酸递送载体，但正在开发可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体。
2、由于使用具有季铵的阳离子性脂质的阳离子性脂质体带正电荷，因此它们可以与带负电荷的核酸通过静电相互作用形成脂质复合物(lipoplex)，从而可以将核酸递送至细胞内。此外，利用季铵与核酸发生静电相互作用，制备不含核酸的阳离子性脂质体的冻干组合物，并通过与核酸的水溶液进行再水合也能够形成脂质复合物，因此显示也可以作为基因导入试剂使用(例如，参照专利文献1和2)。
3、然而，通过这种方法制备的脂质复合物难以控制粒径，并且来自带正电荷的阳离子脂质的细胞毒性成为问题。
4、因此，使用在酸性条件下带正电荷且在中性附近不带电荷的在分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米粒子(称为lipid nanoparticle或lnp)被开发，其正在成为目前最通常使用的非病毒核酸递送载体(例如，参照非专利文献1)。
5、作为使用分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米粒子，也有对离子性脂质赋予分解性基团的例子(例如，参照非专利文献3)。
6、如上所述，已经开发出各种非病毒载体，但核酸通常是不稳定的化合物，因此其作为制剂的稳定性仍然存在问题。
7、现有技术文献
8、专利文献
9、专利文献1：日本专利第4919397号公报
10、专利文献2：日本专利第4598908号公报
11、专利文献3：日本专利第6093710号公报
12、专利文献4：国际公布第2017/218704号
13、专利文献5：国际公布第2021/060440号
14、非专利文献：
15、非专利文献1：gene therapy 6：271-281,1999
16、非专利文献2：biol.pharm.bull.41,1291-1294(2018)
技术实现思路
1、发明所要解决的问题
2、作为提高作为制剂的稳定性的方法之一，尝试将包封有核酸的脂质纳米粒子冷冻干燥，并在使用时进行再水合，以重构脂质纳米粒子(专利文献4和非专利文献2)。
3、虽然这些方法作为提高包封有特定核酸的脂质纳米粒子的保存稳定性的方法是有用的，但作为更简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中的方法存在问题。
4、作为简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中的方法，可以举出如专利文献1和2中记载的方法，制备不含核酸的冻干组合物后再用核酸的水溶液进行再水合的方法。
5、但是，使用在分子内具有叔胺的离子性脂质得到的脂质纳米粒子，由于制备后的表面电荷为弱负电荷至中性，因此不与核酸发生静电相互作用，无法通过专利文献1和2中公开的制备不含核酸的冻干组合物后用核酸水溶液再水合的方法来制备包封核酸的脂质纳米粒子。
6、在这一点上，专利文献5中示出了：在酸性缓冲液中制备不含核酸的脂质纳米粒子，进一步加入冷冻保护剂进行冷冻干燥后，用含核酸的水溶液再水合，由此能够高效且简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。
7、然而，在上述的技术中需要冷冻干燥步骤，因此在简便性的方面尚有改善的余地。
8、本发明鉴于上述问题，其目的在于，提供一种现有技术无法实现的可以高效且简便地包封任意核酸的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法和包括该制造方法的药物组合物的制造方法，以及将核酸导入细胞内或靶细胞内的方法。
9、解决问题的技术方案
10、本发明人鉴于上述问题，经过不懈努力，结果发现，在酸性缓冲液中制备不含核酸的脂质纳米粒子并添加含核酸的水溶液，由此可以高效且简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。此外，使用通过本方法制备的脂质纳米粒子向细胞进行基因导入实验，意外发现，与现有技术相比，基因导入效率提高，从而完成了本发明。
11、即，本发明包括以下内容：
12、[1]一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其包括以下步骤：
13、a)将包含离子性脂质、甾醇和peg脂质的醇溶液与在ph1～6.5具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，以及
14、b)将步骤a中得到的脂质纳米粒子悬浮液不经冷冻干燥地与包含核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物在0～95℃下培育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤。
15、[2]根据[1]所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其在步骤b之后包括以下步骤c：
16、c)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒子的外水相更换为中性缓冲液的步骤。
17、[3]根据[1]或[2]所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，进一步包括：将不含核酸的脂质纳米粒子在-80～0℃下冷冻后，在0～95℃下融解的步骤。
18、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，进一步包括：制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在ph1～6.5具有缓冲作用的其他酸性缓冲液的步骤。
19、[5]根据[1]～[4]中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，醇溶液进一步包含磷脂。
20、[6]根据[1]～[5]中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，离子性脂质是式(1)表示的化合物。
21、[化学式1]
22、
23、(式(1)中，
24、r1a和r1b各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，
25、xa和xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基、或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，
26、r2a和r2b各自独立地表示碳原子数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
27、ya和yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
28、za和zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，
29、na和nb各自独立地为0或1，
30、r3a和r3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基、或式(3)表示的基团：
31、r9-o-co-(ch2)a- (3)
32、(式(3)中，
33、r9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
34、a表示2～10的整数。))。
35、[7]根据[1]～[5]中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，离子性脂质是式(2)表示的化合物。
36、[化学式2]
37、
38、(式中，
39、x表示包含1个以上叔氮的含氮脂肪族基，
40、r1表示碳原子数为8以下的脂肪族烃基，
41、l1表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、n-烷基氨基甲酸酯键、碳酸酯键或脲键，
42、k表示0或1，
43、rx和ry各自独立地表示碳原子数为2～5的亚烷基，
44、l2表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、醚键或脲键，
45、r2表示碳原子数为8以下的亚烷基或不存在，
46、y表示基团，该基团(i)包含1个以上的由可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团、并且(ii)在所述二价基团的芳香环上具有包含选自由酯键和碳酸酯键组成的组中的至少1个的基团、并且(iii)包含选自由碳原子数为10～37的脂肪族烃基、脂溶性维生素残基和甾醇衍生物的残基组成的组中的至少1个。)。
47、[8]一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：使通过[1]～[7]中任一项所述的方法制造的包封核酸的脂质纳米粒子与细胞在生物体外接触的步骤。
48、[9]一种将核酸导入靶细胞内的方法，其包括：向生物体给予通过[1]～[7]中任一项所述的方法制造的包封核酸的脂质纳米粒子的步骤。
49、[10]一种药物组合物的制造方法，其包括[1]～[7]中任一项所述的方法。
50、发明效果
51、在本发明的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法中，由于在制备不含核酸的脂质纳米粒子后不经冷冻干燥地添加核酸水溶液，因此能够高效且简便地制造包封有任意核酸的脂质纳米粒子。此外，与现有技术相比，使用本发明的制造方法制备的包封核酸的脂质纳米粒子的核酸导入效率高，有利于细胞或生物体中的基因导入，特别是作为药物组合物是有用的。
1.一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其在步骤b之后包括以下步骤c：
3.根据权利要求1或2所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，进一步包括：将不含核酸的脂质纳米粒子在-80～0℃下冷冻后，在0～95℃下融解的步骤。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，进一步包括：制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在ph1～6.5具有缓冲作用的其他酸性缓冲液的步骤。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，在步骤a中，醇溶液进一步包含磷脂。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，离子性脂质是式(1)表示的化合物：
7.根据权利要求1～5中任一项所述的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其中，离子性脂质是式(2)表示的化合物：
8.一种将核酸导入细胞内的方法，其包括：使通过权利要求1～7中任一项所述的方法制造的包封核酸的脂质纳米粒子与细胞在生物体外接触的步骤。
9.一种将核酸导入靶细胞内的方法，其包括：向生物体给予通过权利要求1～7中任一项所述的方法制造的包封核酸的脂质纳米粒子的步骤。
10.一种药物组合物的制造方法，其包括权利要求1～7中任一项所述的方法。
