本发明涉及微生物检测，尤其涉及一种具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台及使用方法。
背景技术：
1、针对海水养殖中存在的细菌性病害，各国研究人员为开发快速、准确、有效的诊断方法广泛开展工作，目前主要有微生物生理生化检测、分子生物学方法、免疫学方法和生物芯片等几种方法。
2、其中，微生物生理生化检测方法主要基于形态学检测、生理学和通过一系列的生理生化实验实现对微生物的初步鉴定，其优点是：检测准确，能够通过多个指标进行综合判断，较为灵活，实践较为广泛；缺点是：耗时长、操作繁琐，不利于细菌性病害的快速诊断。分子生物学方法主要包括：聚合酶链反应（pcr）技术、核酸杂交技术等，其优点是：检测灵敏度高，是目前检测灵敏度最高的技术；缺点是：设备昂贵，收集的样品需拿回实验室进行培养鉴定，需要专业技术人员来准备样品和分析结果；同时，分子检测技术无法对样品中微生物的活性进行准确判断。免疫学方法主要包括酶联免疫吸附法（elisa）、免疫层析技术等，其优点是：特异性强，具有较高灵敏度，检测效果较为稳定；其缺点是：免疫操作流程耗时繁琐，无法实现对样品的实时检测。生物芯片方法主要包括基因芯片和蛋白芯片等，其优点是：高通量并行检测、人为操作的误差小、高特异性、高通量；其缺点是：价格昂贵，成本高、蛋白合成困难且极易变性失活，进而影响其性质及功能。
3、并且现阶段国内外对于海洋牧场中病原微生物的检测主要集中在对海洋牧场养殖对象的组织或器官的分析检测，而针对海洋牧场环境中病原微生物的高通量快速检测技术和工程化智能装备相对欠缺，无法满足海洋牧场生物病害防控的现实要求。因此，针对目前海洋牧场养殖鱼类致病微生物发病快、致死率高的情况，亟需一种面向海洋牧场微生物病菌的快速、准确、高灵敏、快速识别的现场即时检测手段。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台及使用方法，所述检测平台为超疏水防生物粘附材料、磁控分离分选和电化学微生物库尔特计数检测传感器三个研究方向技术集成的应用。
2、本发明通过将制备的超滑涂层材料和掺杂了疏水纳米二氧化硅颗粒的pdms微流控芯片表面相偶联，使得微流控芯片通道内表面产生自组装润滑层，利用改性后的pdms@sio2表面羟基与超润滑材料之间的化学反应形成刷毛层式长链结构，实现了通道内液样的滑动式输送。
3、对于传统pdms材质微流控芯片通道90°、120°、180°位置常见的样品残留堵塞问题，本发明通过内表面超滑涂层低阻力和清洗液的反复冲洗解决上述问题。由于本发明提供的芯片通道表面制备方法具有液相工质超滑属性，使得液滴以及液滴内所含的样品无法在通道的转角处滞留，此功能在混合反应区和磁控分选区的效果尤其明显，并且本发明超滑涂层自身结构的耐久性良好。
4、结合微流控芯片致病微生物特异性抗体偶联磁珠在微流控芯片“y”型分选段的定性磁控分离，实现了后续对含鱼类致病微生物的液滴富集，通过本发明芯片检测平台末端的库尔特计数实现对鱼类致病微生物的定量检测，为制造高通量鱼类致病微生物微流控检测装备提供关键的技术支撑。
5、一种具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，所述检测平台包括pdms微流控芯片主体。
6、所述pdms微流控芯片主体包括：有机缓冲液入口（1）、样品原液入口（2）、磁珠抗体混合液入口（3）、混合反应区（4）、定性磁控分选区（5）、富集区（6）、定量计数区（7）和废液出口（8）。
7、进一步的，所述混合反应区（4）为pdms@sio2基底自组装长链超润滑微通道。
8、所述pdms@sio2基底自组装长链超润滑微通道的制备方法包括：
9、s1、将sio2纳米粒子加入到甲苯中搅拌均匀，得到sio2纳米粒子在甲苯中充分分散的混合液；
10、s2、将pdms与所述混合液搅拌均匀后除去甲苯，然后与固化剂按照7:1-9:1的质量比进行混合，得到混合物，接着对混合物进行除泡操作，然后将除泡后的混合物浇注到模具中，形成pdms@sio2基底；
11、s3、将pdms@sio2基底浸渍于ph≥8.5的碱性乙醇溶液中，而后取出蘸有乙醇残液的pdms@sio2基底并风干，接着使用等离子plasma对风干后的基底进行改性；
12、s4、在改性后的pdms@sio2基底表面喷涂甲苯与dcdms的混合液，进行水解反应，然后用甲苯溶液反复冲洗，室温干燥后，得到pdms@sio2基底自组装长链超润滑微通道。
13、进一步的，所述sio2纳米粒子、pdms和甲苯的质量比为5:8:87.2-8:10:87.2。
14、进一步的，步骤s2所述模具的温度为85-100℃，加热1-1.5小时。
15、进一步的，步骤s3所述浸渍的时间为45-60min，步骤s3所述改性的时间为5-10min，改性过程中的o2浓度为65%。
16、进一步的，步骤s4所述水解反应的时间为45-60min。
17、进一步的，所述定性磁控分选区包括利用免疫纳米磁珠捕获病原微生物。
18、进一步的，所述定量计数区为应用电导率变化产生电流的瞬时波动脉冲的库尔特计数方法，实现对样品中致病微生物的定量分析检测功能。
19、进一步的，所述有机缓冲液入口至混合反应区的通道宽度为50±5μm，所述定性磁控分选区的通道宽度为100±10μm，长度1.5-2cm，所述定量计数区嵌入对向电极一对。
20、进一步的，所述电极直径2-2.5mm，两端电极与通道的间距相等，嵌入后用于接触流道内工质及待检液滴，所述对向电极间电压为60-100v，所述待检液滴体积为6±1μl。
21、本发明还提供了利用所述检测平台对样品中致病微生物的检测方法，包括以下步骤：
22、s1、如图2所示搭建微生物检测平台，按照功能需求将：单手操作高精密微流控压力泵flow-ez液体压力控制单元（1）、fluigent流量传感监测单元3个（2）、试管储液池3个（3）、废液储存池1个（4）、本发明微流控芯片主体（5）、芯片夹具（6）、样品原液过滤阀（7）、双通道频率锁相放大器（8）、电流放大器（9）、导线（10）、倒置荧光显微镜系统（11）、便携式计算机（12）按位置关系进行连接搭建；
23、s2、芯片通道冲洗预处理，自图1所示芯片主体有机缓冲溶液入口注入含5%wtsurfactant的 hfe 7500缓冲液，处理时间10-20min，期间通过显微镜观察确保芯片通道内杂质被冲洗干净且缓冲液流动均匀无气泡产生；
24、s3、继s2步骤后，调试频率锁相放大器、流量精密控制单元、电流放大器等，通过设置优选流速来给出缓冲液、免疫纳米磁珠原体液滴、待检病原微生物免疫纳米磁珠液滴等，产生不同阻抗电流的标准参考信号；
25、 s4、海水检测样本预处理，因原位提取的海水样本溶液含杂质较多，需要过滤处理去除容易堵塞芯片通道的大体积杂质，只保留10-50μm尺寸颗粒样，将样本浓度控制在50-300个/μl；
26、s5、检测平台参数范围调节，根据检测样本种类以及检测需求针对性地设置好相关仪器参数，包括缓冲液、样品原液、免疫纳米磁珠混合液入口处的压力控制单元、流量监测单元、电流放大器的放大倍数、锁相放大器激励信号的频率及幅值、采样频率、计算机检测软件模式等；
27、s6、使用压力及流量精密控制软件a-i-o（全称 fluigent all-in-one）结合锁相放大器oe1022自带软件开始试验，按照①先通入缓冲液—流量监测稳定；②打开oe1022、电流放大器、计算机等设备调至信号稳定；③通入样品原液、免疫纳米磁珠混合液，观察液滴生成效果；④开始采样阻抗相应电流脉冲信号；
28、s7、采集原始数据的分析与处理，将收集到的阻抗原始数据—电流脉冲信号，通过labview中的信号峰值处理函数对采样数据进行筛选，获得待测样本的阻抗峰值特征信号。
29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30、1.本发明提供的基于超滑表面改性技术的pdms微通道制备方法，可以极大地提高微通道内液体的通量，与传统方法相比，避免了通道内液体样品残留所造成的二次污染或堵塞风险，操作步骤简单，功能表面稳定性高、耐久性高。
31、2.本发明通过制备的免疫纳米磁珠与磁控分选功能结合，提高了分选效率。
32、3.本发明采用标记型鱼类致病微生物库尔特计数技术，以电导率变化产生电流的瞬时波动脉冲的库尔特计数方法，实现了鱼类致病微生物定量检测。
33、4.本发明相比传统的实验室孵育法、显微镜计数法等，具有检测样品用量少，耗时短等优点。
1.一种具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述检测平台包括pdms微流控芯片主体；
2.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述sio2纳米粒子、pdms和甲苯的质量比为5:8:87.2-8:10:87.2。
3.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，步骤s2所述模具的温度为85-100℃，加热1-1.5小时。
4.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，步骤s3所述浸渍的时间为45-60min，步骤s3所述改性的时间为5-10min，改性过程中的o2浓度为65%。
5.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，步骤s4所述水解反应的时间为45-60min。
6.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述定性磁控分选区包括利用免疫纳米磁珠捕获病原微生物。
7.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述定量计数区为应用电导率变化产生电流的瞬时波动脉冲的库尔特计数方法，实现对样品中致病微生物的定量分析检测功能。
8.根据权利要求1所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述有机缓冲液入口至混合反应区的通道宽度为50±5μm，所述定性磁控分选区的通道宽度为100±10μm，长度1.5-2cm，所述定量计数区嵌入对向电极一对。
9.根据权利要求8所述具有超滑表面的磁控鱼类致病微生物微流控芯片检测平台，其特征在于，所述电极直径2-2.5mm，两端电极与通道的间距相等，嵌入后用于接触流道内工质及待检液滴，所述对向电极间电压为60-100v，所述待检液滴体积为6±1μl。
