本发明属于发酵，具体涉及一种长链二元酸的生产方法。
背景技术：
1、长链二元酸有着非常广泛的工业用途。以长链二元酸为原料可以合成特种聚酰胺、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。目前生产长链二元酸的方法有催化油脂法、化学合成法和微生物发酵法，其中化学合成法路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此处于规模化生产级别的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。微生物发酵法常以石油基的烷烃为发酵底物，通过微生物发酵转化得到长链二元酸，其生产过程常温、常压，可以实现规模化工业生产。虽然在生产长链二元酸时可以选择以脂肪酸或其衍生物等新型植物基的资源作为发酵底物，但是相关工程菌株或工艺普遍存在二元酸产量低、放大生产效率低的问题，难以在工业上推广应用。
技术实现思路
1、本发明的目的旨在提供一种长链二元酸的生产方法，其通过使用维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302高效利用脂肪酸或其衍生物的发酵底物，在酸性或碱性的不同发酵条件发酵生产长链二元酸，显著提高目标链长的长链二元酸产量，还可以提高长链二元酸的生物基含量，所述生产方法具有工业化放大生产的潜力。
2、本发明所述长链二元酸的通式为hooc(ch2)ncooh，其中n为6～18，具体地，所述长链二元酸选自辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的任意一种。
3、本发明提供了一种长链二元酸的生产方法，其包括：发酵培养维斯假丝酵母菌获得发酵液，以及从发酵液中提取长链二元酸；所述维斯假丝酵母菌是维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302，保藏编号是cctcc no：m20232153；发酵底物选自碳原子数为9～18的长链脂肪酸、长链脂肪酸酯或长链烷烃中一种或多种的组合。
4、本发明所述维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302于2023年11月8日进行生物保藏，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，分类命名为维斯假丝酵母(candida viswanathii)。
5、本发明所述维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302通过诱变筛选获得，其经its(internal transcribed spacer)序列鉴定属于维斯假丝酵母(candidaviswanathii)，its序列参考genbank号mk394122.1，或者参考中国专利申请cn111748480b说明书中公开的序列seq id no:1。
6、具体地，所述诱变筛选方法包括如下步骤：将出发菌株维斯假丝酵母(candidaviswanathii)caes2113(保藏编号：cctcc no：m 2020048，公开于中国发明专利cn111748480b)甘油管接入装有ypd培养基的摇瓶中，加入0.02％～0.05％的化学诱变试剂(例如5-氟尿嘧啶)，在29～31℃、200～250rpm震荡培养24h。取生长好的培养液离心收集菌体并用生理盐水洗涤3～5次，稀释至菌浓度为106cfu/ml，再利用紫外线诱变，操作条件：紫外线波长260mm，紫外灯功率20w，照射距离20cm，照射时间为30s～1min，边照射变搅拌菌液，以致死率为80％为标准。紫外诱变处理后进行避光冰浴1～2h，梯度稀释，吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板，避光培养至产生单菌落。挑取生长良好的单克隆至装有初筛培养基的孔板，其中初筛培养基含有1％～3％长链脂肪酸酯或长链脂肪酸，29～31℃下自然ph值发酵，发酵周期70～80小时。发酵结束后初筛，从中挑取相对高产的目标链长长链二元酸的菌株，然后再将这些菌株经孔板和摇瓶发酵复筛，最终得到稳定高产菌株，保存于甘油管中，使用its(internal transcribed spacer)序列鉴定属于维斯假丝酵母。
7、在一些实施方式中，所述长链脂肪酸选自九烷酸、十烷酸、十一烷酸、月桂酸(别名：十二烷酸)、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸(别名：十六烷酸)、十七烷酸和十八烷酸中的一种或多种的组合。
8、在一些实施方式中，所述长链脂肪酸酯选自碳原子数为9～18的脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸丙酯或脂肪酸丁酯中的一种或多种的组合。
9、在一些实施方式中，所述长链脂肪酸酯选自九烷酸酯、十烷酸酯、十一烷酸酯、月桂酸酯、十三烷酸酯、肉豆蔻酸酯、十五烷酸酯、棕榈酸酯、十七烷酸酯或十八烷酸酯中的一种或多种的组合。
10、在一些实施方式中，所述长链脂肪酸酯选自月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸乙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯或棕榈酸丁酯中的一种或多种的组合。
11、在一些实施方式中，所述长链烷烃选自壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷中的一种或多种的组合，更优选为长链正烷烃。所述长链烷烃可以是来源于石油、煤的石油基烷烃或煤制烷烃，也可以是通过植物油脂加工获得的生物基烷烃。
12、当使用的发酵底物来源于植物油脂，例如椰子油或棕榈油等，则经发酵转化获得的相应长链二元酸将具有相应生物基含量。例如，月桂酸可以通过椰子油水解或高温高压分解得到，月桂酸甲酯可以由月桂酸和甲醇通过酯化反应制备而成，采用该类月桂酸或月桂酸甲酯作为发酵底物发酵生产的十二碳二元酸将具有相应生物基含量。
13、在一些实施方式中，所述长链烷烃是石油基正烷烃或生物基正烷烃。
14、在一些实施方式中，所述发酵底物选自以下组合中的一种或多种的组合：长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的组合；长链脂肪酸和长链烷烃的组合；长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合；长链脂肪酸盐和长链烷烃的组合；或，长链脂肪酸、长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合。以上由两种或三种不同类型的发酵底物构成的组合中，不同类型发酵底物的质量比没有特别限定。例如，当发酵底物是长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的组合时，长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的质量比没有特别限定，例如可以是1:99～99:1。
15、在一些实施方式中，所述发酵底物是质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸和长链烷烃的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸盐和长链烷烃的组合；或者，任意质量比的长链脂肪酸、长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合。
16、在一些具体地实施方式中，当发酵生产十二碳二元酸时，所述发酵底物选自十二烷、月桂酸、月桂酸酯、月桂酸和十二烷的组合、月桂酸酯和十二烷的组合、月桂酸和月桂酸酯的组合中的任意一种，其中月桂酸酯是月桂酸甲酯或月桂酸乙酯。
17、在一些具体地实施方式中，当发酵生产十四碳二元酸时，所述发酵底物选自十四烷、肉豆蔻酸、肉豆蔻酸酯、肉豆蔻酸和十四烷的组合、肉豆蔻酸酯和十四烷的组合、肉豆蔻酸和肉豆蔻酸酯的组合中的任意一种，其中肉豆蔻酸酯是肉豆蔻酸甲酯或肉豆蔻酸乙酯。
18、在一些具体地实施方式中，当发酵生产十六碳二元酸时，所述发酵底物选自十六烷、棕榈酸、棕榈酸酯、棕榈酸和十六烷的组合、棕榈酸酯和十六烷的组合、棕榈酸和棕榈酸酯的组合中的任意一种，其中棕榈酸酯是棕榈酸甲酯或棕榈酸乙酯。
19、在一些实施方式中，发酵培养的温度为28℃～35℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
20、在一些实施方式中，发酵培养的风量为0.2～0.8vvm，例如0.2vvm、0.3vvm、0.4vvm、0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm或0.8vvm。
21、在一些实施方式中，发酵培养的压力为0.05～0.2mpa，例如0.05mpa、0.08mpa、0.11mpa、0.12mpa、0.15mpa、0.2mpa。
22、在一些实施方式中，发酵培养的溶氧为10～90％，例如10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％或90％。优选为20～80％。
23、在一些实施方式中，发酵培养是酸性条件；优选地，发酵培养时的ph值为4.5～6.9，进而为4.5～6.5，例如4.5、4.8、5.0、5.5、5.8、6.0、6.4或6.5。具体可以通过加入氢氧化钠或稀硫酸进行调节。
24、在一些实施方式中，发酵培养是碱性条件；优选地，发酵培养时的ph值为7.0～7.5，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。具体可以通过加入氢氧化钠或稀硫酸进行调节。
25、在一些实施方式中，发酵培养时，当稀释30倍的菌株光密度od620达到0.5～1.0，较佳地为0.7～1.0时，例如0.7、0.8、0.9或1.0，加入发酵底物开始进行发酵转化。
26、在一些实施方式中，所述发酵底物加入方式是一次加入、批次补加或连续流加。
27、优选地，发酵培养时，所述发酵底物的浓度控制在8％(v/v)以下，优选为0.01～5％(v/v)，例如0.5％、1％、2％。
28、在一些实施方式中，当发酵底物是固态时，先加热使其溶解，再投入发酵液；其中，加热发酵底物的温度可以为45～65℃，例如45℃、50℃、55℃。
29、在一些实施方式中，发酵时间为130～180小时。
30、在一些实施方式中，发酵培养的培养基至少含有碳源、氮源和/或无机盐。
31、在一些优选实施方案中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、山梨醇、阿拉伯糖、鼠李糖、纤维二糖、槐糖、龙胆二糖中的一种或多种的组合，更优选选自葡萄糖、乳糖、蔗糖中的一种或多种的组合。
32、在一些优选实施方案中，所述氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、铵盐和硝酸盐中的一种或多种的组合。
33、在一些优选实施方案中，所述无机盐选自硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种的组合，更优选选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钙和硝酸钾中的一种或多种的组合。
34、在一些优选实施方案中，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基，两者均含有所述碳源、所述氮源和所述无机盐。维斯假丝酵母菌先在种子培养基中培养，再接种到发酵培养基中培养和发酵转化。
35、在一些具体地实施方式中，所述种子培养基至少含有蔗糖1％～3.5％、玉米浆0.1％～1.5％、酵母膏0.1％～1.0％、磷酸二氢钾0.2％～2.0％、尿素0.1％～0.8％、消泡剂0.01％～0.10％(w/v)。
36、在一些具体地实施方式中，所述发酵培养基至少含有葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～1.0％、酵母膏0.1％～0.6％、硝酸钾0.1％～0.8％、磷酸二氢钾0.1％～0.8％、硫酸铵0.05％～0.35％、尿素0.02％～0.30％、氯化钠0.05％～0.40％(w/v)。
37、优选地，所述消泡剂包括聚醚类消泡剂、有机硅消泡剂、硅醚复合消泡剂、矿物油类消泡剂或非离子表面活性剂，可以列举的例如市售聚醚类消泡剂、陶氏df-103消泡剂、sigma aldrich的消泡剂204、聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油等。
38、在一些实施方式中，发酵培养时，维斯假丝酵母菌的接种量为发酵培养基的5～50％(v/v)，即种子液与发酵培养基之间的体积比为(5～50)：100。
39、在一些实施方式中，所述提取包括调节发酵液的ph值至2～5，固液分离，得到长链二元酸粗品。具体可以使用稀硫酸、稀盐酸进行ph值调节。
40、在一些实施方式中，所述固液分离可以采用离心或者过滤的方式，以将固体和液体分离。
41、在一些实施方式中，本发明提供了一种发酵液，其含有维斯假丝酵母(candidaviswanathii)cath2302和长链二元酸，所述维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302的保藏编号是cctcc no：m 20232153，所述长链二元酸的生物基含量为1～100％。
42、采用本发明方法制备获得的长链二元酸产品，生物基含量为1～100％，进一步为5～100％。生物基含量可以通过测定放射性c14含量的方法进行，例如美国材料试验协会的标准astm-d6866法。
43、本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
44、1，本发明的维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302不仅可以利用传统烷烃作为发酵底物，还可以高效利用脂肪酸衍生物，例如长链脂肪酸、长链脂肪酸酯等作为发酵底物，尤其还可以利用长链脂肪酸、长链脂肪酸酯及其与长链烷烃的组合物作为发酵底物，生产目标长链二元酸的产量显著提高，相对于现有菌株有明显程度的改善，并具有工业放大生产的潜力。
45、2，本发明的维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302及长链二元酸的生产方法中，发酵转化不仅可以在碱性条件下进行，更可以在酸性条件下进行(例如ph值在6.5以下)，尤其是当发酵条件为酸性，能有效减少发酵过程中碱液的用量，使发酵液、发酵处理液和废水中盐含量大量降低，同时简化了后续的提取长链二元酸的工艺。
46、3，部分脂肪酸及其衍生物类发酵底物是来自棕榈树、椰子树等富含油脂的热带作物的种子，这种新型的可再生资源可以代替石油烷烃等化石原料，对工业过程的可持续发展具有重要意义。
47、菌种保藏信息：
48、维斯假丝酵母(candida viswanathii)cath2302，保藏编号是cctcc no：m20232153，保藏日期为2023年11月8日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，分类命名为维斯假丝酵母(candida viswanathii)。
1.一种长链二元酸的生产方法，其包括：发酵培养维斯假丝酵母菌获得发酵液，以及从发酵液中提取长链二元酸，其特征在于，所述维斯假丝酵母菌是维斯假丝酵母(candidaviswanathii)cath2302，保藏编号是cctcc no：m 20232153；发酵底物选自碳原子数为9～18的长链脂肪酸、长链脂肪酸酯或长链烷烃中的一种或多种的组合。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述长链脂肪酸选自九烷酸、十烷酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸和十八烷酸中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述长链脂肪酸酯选自九烷酸酯、十烷酸酯、十一烷酸酯、月桂酸酯、十三烷酸酯、肉豆蔻酸酯、十五烷酸酯、棕榈酸酯、十七烷酸酯或十八烷酸酯中的一种或多种的组合；或者，所述长链脂肪酸酯选自月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸乙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯或棕榈酸丁酯中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述长链脂肪酸酯选自月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸乙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯或棕榈酸丁酯中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述长链烷烃选自壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述长链烷烃是石油基正烷烃或生物基正烷烃。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述发酵底物是质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸和长链脂肪酸酯的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸和长链烷烃的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合；质量比为1:99～99:1的长链脂肪酸盐和长链烷烃的组合；或者，任意质量比的长链脂肪酸、长链脂肪酸酯和长链烷烃的组合。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，发酵培养的温度为28℃～35℃，和/或，溶氧为10～90％，和/或，风量为0.2～0.8vvm，和/或，压力为0.05～0.2mpa，和/或，发酵培养是酸性条件或碱性条件。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，发酵培养时，所述发酵底物的浓度控制在8％以下，进而为0.01～5％。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述提取包括调节发酵液的ph值至2～5，固液分离，得到长链二元酸粗品。
