本发明涉及烟叶发酵，具体领域为一种茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法。
背景技术：
1、在雪茄茄芯烟叶的农业发酵过程中，虽然观察到大多数挥发性香味成分的含量会上升，但这些在发酵过程中生成的挥发性香味成分通常具有热不稳定、活性高且含量低的特点，这增加了对雪茄茄芯烟叶农业发酵进程准确评估的难度。目前，雪茄烟挥发性香味成分的检测主要采用气相色谱质谱法(gc-ms)、气相色谱-嗅觉检测法(gc-o)和电子鼻技术等单一技术检测方法。gc-ms和gc-o虽然能够提供较为可靠的定性、定量信息，探测到更多的挥发性香味成分，但这些技术无法实现对发酵进程的实时监测，并且存在样品前处理周期长和分析速度缓慢等缺点。
2、电子鼻技术是利用一系列选择性电化学传感器和适当的识别算法将化学信号转化为电信号，适用于复杂挥发性香味成分的识别，包括食品、烟草及香精香料的质量检测、医学诊断和爆炸物检测等领域。该技术可实现发酵进程的实时监测，但电子鼻无法准确定量各种具体挥发性化学组分的变化情况，且受环境温湿度影响大。gc-ims技术具备高灵敏度和高分辨率，能够快速、精确地检测到微量的挥发性有机化合物，能够对发酵进程实时监测。此外，gc-ims可以在不影响发酵过程的前提下进行多次采样和检测，保持样品的完整性和自然发酵状态。同时其检测结果以指纹图谱成像的方式直观呈现，便于直接观察。
3、氨基酸及有机酸等关键代谢产物，是茄芯烟叶发酵过程中的挥发性香味成分形成的重要前体物质，也是烟叶发酵质量的关键影响因素。目前虽然现有的茄芯烟叶发酵进程标志物的检测方法不少，但并没有能实现样品实时监测、可视化挥发性化合物图像变化特征且检测效果满意的方法。而且，由于代谢产物的种类繁多，如何筛选特征标志物，实现靶向监测，更是当前研究的空白。
4、因此，如何研发一种能够实现样品快速检测且检测的信号响应好、灵敏度高、检测速度快、重复性好的技术并结合化学计量学分析，靶向监测特征标志物，实现茄芯烟叶农业发酵进程的快速精准判别，是本领域目前亟需解决的问题之一。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测系统及方法，能够实时监测分析雪茄烟叶农业发酵不同时期挥发性香味及代谢成分，并基于挥发性香味及代谢成分数据进行化学计量学分析，实现对茄芯烟叶农业发酵不同进程差异性标志物的快速靶向监测。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法：采集茄芯烟叶农业发酵第0-10天(发酵前期)、第11-31天(发酵中期)、第32-45天(发酵后期)的样品，利用电子鼻(e-nose)、气相色谱-离子迁移谱联用仪(gc-ims)、全自动氨基酸分析仪和液相质谱联用仪(lc-ms/ms)快速检测茄芯烟叶的挥发性香味成分及相关代谢物组分；根据农业发酵不同时期的挥发性香味成分及代谢组分特点，结合化学计量学分析对不同发酵时间茄芯烟叶进行区分并筛选不同发酵阶段茄芯烟叶的差异性标志物。
4、具体包括以下步骤：
5、(1)样品信息实时采集：采集茄芯烟叶农业发酵第0-10天、第11-31天、第32-45天的样品，所有样品均属同一产地、同一品种以及同一原烟等级的茄芯中部烟叶；
6、(2)电子鼻嗅闻：采用e-nose pen3检测仪对步骤(1)中农业发酵不同时期的茄芯烟叶样品进行检测，得到样品的差异信息，根据电子鼻的10个传感器响应值，筛选高响应参数；
7、(3)指纹图谱成像：采用hs-gc-ims检测分析技术对步骤(1)中农业发酵不同时期的茄芯烟叶样品进行检测，得到样品的指纹图谱特征信息；
8、(4)指纹图谱数据库建立：选取步骤(3)中所得到的样品指纹图谱特征信息，用仪器配套的分析软件对样本数据进行统计分析，建立不同酵阶茄芯烟叶样品的gc-ims谱图数据库；
9、(5)代谢产物分析：采用氨基酸全自动分析仪和lc-ms/ms检测分析技术对步骤(1)中农业发酵不同时期的茄芯烟叶样品进行检测，得到样品的游离氨基酸及有机酸含量变化特征信息；
10、(6)代谢物数据库建立：选取步骤(5)中所得到的游离氨基酸及有机酸含量变化特征信息，用仪器配套的分析软件对样本数据进行统计分析，建立不同酵阶茄芯烟叶样品的关键代谢物数据库；
11、(7)化学计量分析数据矩阵构建：选取步骤(4)和步骤(6)所得的谱图及代谢物数据进行缺失值处理和离群值处理，构建化学计量分析所需全部数据矩阵；
12、(8)茄芯烟叶不同酵阶差异性标志物的筛选：对步骤(7)所得的数据矩阵，运用化学计量学方法筛选特征化合物，所述化学计量学方法为opls-da判别分析法，容忍度与方差扩大因子值的计算筛选和lasso回归分析法；
13、(9)差异性标志物验证：将步骤(7)中筛选的特征化合物构建数据集，结合roc曲线和auc值验证差异性标志物的准确率及可靠性。
14、其中，所述电子鼻的10个传感器包括：w1c，对芳香性化合物敏感；w5s，对氮氧化物敏感；w3c，对氨类、芳香族化合物敏感；w6s，对氢类物质敏感；w5c，对烷烃、芳香族化合物敏感；w1s，对甲基类敏感；w1w，对无机硫化物、萜烯类敏感；w2s，对醇类、部分芳香族化合物敏感；w2w，对芳香族化合物、有机硫化物敏感；w3s，对烷烃敏感。
15、其中，利用电子鼻快速嗅闻发酵茄芯烟叶样品的挥发性香味组分变化，分别准确称取不同酵阶茄芯烟叶样品置于20ml进样瓶中，并用进样瓶盖旋紧密封，置于60℃水浴锅中水浴加热10min，检测时零气针和电子鼻进样针同时插入顶空进样瓶中进行采样，将挥发性气体吸入电子鼻传感器系统中进行检测，电子鼻的传感器仓流量为400ml/min，初始注射流量为400ml/min，采样间隔1.0s，清洗时间90s，归零时间5s，预进样时间5s，测量时间150s。
16、其中，利用气相色谱-离子迁移谱联用仪快速检测茄芯烟叶样品的挥发性香味成分，具体方法为：准确称取发酵雪茄烟叶样品0.5g置于20ml顶空瓶中，80～100℃孵育10～15min后进样，进样体积为100～200μl，不分流进样；孵化转速为500r/min，进样针温度为80～85℃。色谱柱温度为60℃，载气为高纯氦(纯度≥99.999％)；
17、升压程序为：初始流量2.00ml/min保持2min，在8min内线性增至10.00ml/min，在10min内线性增至100.00ml/min，保持10～20min；色谱运行时间：30～40min；进样口温度：80℃；电离源为氚源(3h)，迁移管长度为53mm，电场强度为500v/cm，迁移管温度为45℃，漂移气为高纯氮气(纯度≥99.999％)；流速为150ml/min，正离子模式；
18、获得三维信息谱图，获取挥发性化合物图像特征；
19、对三维信息谱图的图像特征进行数据分析：检测6种酮的混标，建立保留时间和保留指数的校准曲线，随后通过目标物的保留时间计算出该物质的保留指数，使用vocal软件内置的gc保留指数(nist 2020)数据库和ims迁移时间数据库检索和比对，并对获得的三维信息谱图的图像特征进行分析，获得茄芯烟叶样品不同酵阶挥发性香味成分组成。
20、其中，利用氨基酸全自动分析仪检测不同酵阶茄芯烟叶样品的游离氨基酸含量：准确称取0.4g不同酵阶茄芯烟叶样品于50ml离心管中，加入8ml 4％磺基水杨酸，涡旋机充分涡旋混匀后放入离心机10000rpm离心5min，然后取1ml上清液，通过0.22μm滤膜过滤于1.5ml进样瓶中，配置ph值为3.45的缓冲液a、ph值为10.85的缓冲液b、再生液、钾钠缓冲溶液、茚三酮溶液和清洗液，然后将配制的所有溶液超声30min，并通过0.22μm的水相和有机相滤膜进行过滤，进行上机检测，并以氨基酸混标溶液作为内标进行定量；
21、利用lc-ms/ms检测不同酵阶茄芯烟叶样品的有机酸含量：准确称取0.5g冻干烟叶粉末样品，加入5ml超纯水，使用均质机充分均质后，超声提取1小时，然后再加入5ml色谱级乙醇溶液，离心机中10000r/min离心3min，取上清液过滤膜，先过0.45μm的有机滤膜，再过0.22μm的有机滤膜。滤液取200μl于衬管中，置于1.5ml的进样瓶中，等待进样，进行有机酸检测分析，并以草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸6种有机酸标品构建标准曲线，对茄芯烟叶中的有机酸含量进行定量。
22、其中，lc的条件为：eclipse plus c18色谱柱(4.6mm×250.0mm,5μm)，以甲醇和0.1％甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；
23、流动相a为甲醇溶液：流动相b为0.1％甲酸水溶液，洗脱比例为3：97；流速为0.80ml/min；柱温为30℃；进样量为5.0μl；
24、mc的条件为：电喷雾离子源，选择负离子检测模式，喷雾电压为3200v，鞘气流速50arb，辅助气流速20arb，辅助气温度400℃，离子传输管温度500℃，扫描范围50-750m/z。
25、其中，基于不同酵阶茄芯烟叶样品挥发性香味成分及代谢物含量的数据，进行成分分析，得到茄芯烟叶农业发酵不同时期分组数据；根据茄芯烟叶不同酵阶分组数据，结合opls-da判别分析和lasso回归分析，筛选特征标志物；
26、根据筛选的特征标志物，构建差异性标志物矩阵。所述差异性标志物矩阵用于化学计量分析前，还进行数据预处理，所述数据预处理包括：删除缺失值大于20％的特征，使用至少一种缺失值处理法；所述缺失值处理法包括：不填补法、均值填补法、回归填补法或missforest法中的至少一种；数据处理完成后，构建化学计量分析所需全部数据矩阵；
27、利用roc曲线和auc值验证实时监测特征标志物的可靠性。
28、优选地，所述数据预处理包括对数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐。
29、其中，步骤(8)中，采用opls-da分析对步骤(4)和步骤(6)检测出来的农业发酵不同时期的茄芯烟叶的风味成分图谱信息及氨基酸和有机酸含量进行分析，结合vip值>1，差异倍数(fc)>2和p<0.05的代谢物具有更好的鉴别区分特点，筛选出vip值前10的挥发性风味化合物及相关代谢物进行vif计算，筛选出vif<10的挥发性风味化合物及相关代谢物，进一步结合lasso回归分析，筛选差异性标志物，并利用roc曲线和auc值验证差异性标志物的准确性和可靠性，实现雪茄烟叶农业发酵不同时期的有效鉴别。
30、本发明还提供了一种茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测系统，包括样品信息实时采集模块、电子鼻嗅闻模块、指纹图谱成像模块和代谢物分析模块。基于不同酵阶特征性标志物，通过特征化合物采集检测仪器，靶向检测特征化合物，结合电子鼻嗅闻模块、指纹图谱成像模块和代谢物分析模块，多维度实时监测茄芯烟叶的农业发酵进程。
31、其中，所述样品信息实时采集模块包括连接管，所述连接管与茄芯烟叶发酵堆内部连通，实时监测茄芯烟叶农业发酵进程，准确判别发酵时期；
32、所述连接管为pe管或pb管或不锈钢管，内径为2-4mm。
33、其中，所述指纹图谱成像模块采用的载气和飘移气均为高纯度氮气，分析仪的毛细管柱选用db-wax毛细管柱，毛细管柱温度为60℃，离子迁移谱的漂移管温度为45℃，每次发酵气体进样分析的进样体积为0.1-0.5ml。
34、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
35、(1)本发明茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法有效结合电子鼻嗅闻模块、指纹图谱成像模块、代谢物分析模块和化学计量学分析，全面多维度解析不同酵阶茄芯烟叶的变化特征。
36、(2)电子鼻嗅闻模块和指纹图谱成像模块中的发酵雪茄烟叶样品无需任何前处理过程，避免了外来溶剂干扰，可以实现对发酵烟叶的实时监测。
37、(3)本发明将气相色谱的高效分离与离子迁移谱的痕量快速分析优势相结合，实现二次分离，有效区分农业发酵不同时期雪茄烟叶的特征风味成分。
38、(4)本发明采用opls-da判别分析和lasso回归分析对农业发酵不同时期茄芯烟叶的风味成分和代谢产物进行分析，筛选不同酵阶茄芯烟叶的差异性标志物。
39、(5)本发明基于筛选的特征化合物，结合roc曲线和auc值验证了特征化合物的准确性和可靠性。
40、(6)本发明的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测系统能够快速且准确实时监测雪茄烟叶农业发酵进程，具有操作简便，结果直观的优点，为雪茄烟叶农业生产阶段的机械化智能化控制提供了新的技术方法。
1.一种茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：采集茄芯烟叶农业发酵前、中、后期样品，利用电子鼻、气相色谱-离子迁移谱联用仪、全自动氨基酸分析仪和液相质谱联用仪快速检测茄芯烟叶的挥发性香味成分及相关代谢物组分；根据农业发酵不同时期的挥发性香味成分及代谢组分特点，结合化学计量学分析对不同发酵时间茄芯烟叶进行区分并筛选不同发酵阶段茄芯烟叶的差异性标志物。
2.根据权利要求1所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：所述电子鼻的10个传感器包括：w1c，对芳香性化合物敏感；w5s，对氮氧化物敏感；w3c，对氨类、芳香族化合物敏感；w6s，对氢类物质敏感；w5c，对烷烃、芳香族化合物敏感；w1s，对甲基类敏感；w1w，对无机硫化物、萜烯类敏感；w2s，对醇类、部分芳香族化合物敏感；w2w，对芳香族化合物、有机硫化物敏感；w3s，对烷烃敏感。
4.根据权利要求3所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：利用gc-ims快速检测茄芯烟叶样品的挥发性香味成分，具体为：准确称取发酵雪茄烟叶样品0.5g置于20ml顶空瓶中，80～100℃孵育10～15min后进样，进样体积为100～200μl，不分流进样；孵化转速为500r/min，进样针温度为80～85℃。色谱柱温度为60℃，载气为高纯氦；
5.根据权利要求4所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：利用氨基酸全自动分析仪检测不同酵阶茄芯烟叶样品的游离氨基酸含量：准确称取0.4g不同酵阶茄芯烟叶样品于50ml离心管中，加入8ml 4％磺基水杨酸，涡旋机充分涡旋混匀后放入离心机10000rpm离心5min，然后取1ml上清液，通过0.22μm滤膜过滤于1.5ml进样瓶中，配置ph值为3.45的缓冲液a、ph值为10.85的缓冲液b、再生液、钾钠缓冲溶液、茚三酮溶液和清洗液，然后将配制的所有溶液超声30min，并通过0.22μm的水相和有机相滤膜进行过滤，进行上机检测，并以氨基酸混标溶液作为内标进行定量。
6.根据权利要求5所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：利用lc-ms/ms检测不同酵阶茄芯烟叶样品的有机酸含量：准确称取0.5g冻干烟叶粉末样品，加入5ml超纯水，使用均质机充分均质后，超声提取1小时，然后再加入5ml色谱级乙醇溶液，离心机中10000r/min离心3min，取上清液过滤膜，先过0.45μm的有机滤膜，再过0.22μm的有机滤膜；滤液取200μl于衬管中，置于1.5ml的进样瓶中，等待进样，进行有机酸检测分析，并以草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸6种有机酸标品构建标准曲线，对茄芯烟叶中的有机酸含量进行定量。
7.根据权利要求6所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：lc的条件为：eclipse plus c18色谱柱，以甲醇和0.1％甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；
8.根据权利要求7所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测方法，其特征在于：基于不同酵阶茄芯烟叶样品挥发性香味成分及代谢物含量的数据，进行成分分析，得到茄芯烟叶农业发酵不同时期分组数据；根据茄芯烟叶不同酵阶分组数据，结合opls-da判别分析和lasso回归分析，筛选特征标志物；
9.采用权利要求1-8任一所述监测方法的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测系统，其特征在于：包括样品信息实时采集模块、电子鼻嗅闻模块、指纹图谱成像模块和代谢物分析模块。
10.根据权利要求9所述的茄芯烟叶发酵过程多维度实时监测系统，其特征在于：所述样品信息实时采集模块包括连接管，所述连接管与茄芯烟叶发酵堆内部连通，实时监测茄芯烟叶农业发酵进程，准确判别发酵时期；
