本发明涉及转基因及植物病害防治领域，具体涉及利用crispr/cas9技术靶向编辑水稻光系统i亚基ospsal基因及其在抗水稻病毒的应用。
背景技术：
1、水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)又被称为水稻条纹叶枯病毒，属于纤细病毒属(tenuivirus)，以灰飞虱(laodelphax striatellus)为媒介传播。rsv病毒是负义单链rna(-ss rna)病毒，其基因组按分子量递减的顺序分别命名为rna1、rna2、rna3和rna4，编码7种蛋白质，每个病毒蛋白都具有不同的功能以促进病毒的侵染复制。其中，rna1在互补链上编码一个337kda的rna依赖的rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase，rdrp)，主要协助病毒复制，其他三个rna各自具有双向编码策略，在rna的5'端的开放读框编码蛋白p2-p4，在互补链上编码蛋白pc2-pc4。pc2通过克服昆虫障碍参与媒介传播，p2蛋白行使沉默抑制子功能；pc3是核衣壳蛋白，同时也被认为在水稻条纹病毒经卵传播中发挥关键作用；p3是沉默抑制子，与宿主蛋白竞争双链和单链sirna以阻止沉默复合物的形成；pc4(32kda)主要分布在细胞壁附近或细胞壁内，被认为是一种运动蛋白；p4是一种非结构特异性蛋白。
2、水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播的一种病毒性病害，水稻一旦染病对产量影响极大.而且防治非常困难。一般发病田块产量损失在20％-30％，严重田块会造成绝收。目前该病在江苏、河南等省已成为重大的暴发性病害，是我国水稻上一种分布区域广、发生程度重、危害大的重要病毒病。因此，防治水稻条纹叶枯病关乎国计民生，采取有效的防治措施非常必要；目前为止，防治水稻条纹叶枯病最经济有效的措施是培育抗病性品种，因此培育水稻转基因抗性材料，能够为作物抗病育种提供重要的理论和技术指导。
3、近年来，南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)作为一种严重威胁水稻生产的病毒引起了广泛关注，该病毒具有高度潜伏性和极强的破坏性，且难以有效防治。南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus，srbsdv)是一种双链rna(double-stranded rna，dsrna)病毒，属于呼肠孤病毒科(reoviridae)下的斐济病毒属(fijivirus)。srbsdv是一种无包膜的二十面体病毒，其基因组由10个双链rna片段组成，近年来系统进化树分析表明srbsdv与水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarfvirus,rbsdv)的基因序列同源性很高。类比rbsdv研究人员发现srbsdv p5-1，p6，p9是病毒复制毒质的重要组成部分。其中p6蛋白可以通过与乙烯信号途径关键转录因子osrth2互作协调病毒感染与传播。p7-2与s-phase kinase-associated protein 1(osskp1)相互作用形成scf复合物。p8蛋白编码病毒的内层衣壳蛋白，具有抑制转录活性的功能，通过与水稻生长素途径转录因子osarf17互作抑制其介导的抗病毒防御反应。p10编码的外壳蛋白，能够激发内质网应激反应。针对srbsdv的研究采取了多种策略，包括筛选抗病品种、改良栽培技术、利用生物防治剂等。此外，利用转基因技术开发抗病水稻也是研究的热点之一，尽管目前仍处于实验室阶段。因此，需要进一步深入和系统地研究，加强科学研究，探索病毒的生物学特性和侵染机制，以有效防治srbsdv，保障水稻生产的稳定性和可持续发展。
4、光合作用是高等植物将阳光转化为化学能的主要过程。光合作用的光反应是由光系统i和ii(psi和psii)驱动的。psi是一种膜蛋白复合物，作为光合机制的一个组成部分，它能够实现阳光驱动的跨膜电子转移。作为psi的一个组成部分，psal对psi三聚体的形成至关重要，这一过程可能依赖于钙离子与psal亚基的结合。然而基于目前的研究，psal与水稻抗病毒机制的关系尚无人详细研究。
5、基于现有技术的缺陷，本发明的发明人以crispr/cas9基因编辑系统对ospsal进行靶向编辑，通过构建yl-hu-ospsal的敲除载体，通过水稻愈伤转染技术转化水稻日本晴nip成熟胚诱导形成的愈伤组织。获得t0代转基因水稻种子后，继续扩繁，得到t1代的种子，提取t1代单株幼叶dna，用靶点特异性引物扩增sgrna靶向位点，进行测序，从而获得稳定遗传的纯合突变体转基因植株。
技术实现思路
1、本发明涉及利用crispr/cas9技术靶向编辑水稻光系统i亚基ospsal基因。
2、一方面，所述ospsal基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、atggccactgcttatgctcccatggcgagccagctgatgaagagcagcttggtgtgctccaagccgagggggctgtctggtgcttcgctgacaaggaggccccgcttcacagtcaaggccatccagtctgagaagccaacgtaccaggtggtgcagcccatcaatggcgaccccttcatcggcagcctggagacgccggtgacctccagcccgctggtcgcctggtacctctccaacctcccggcgtaccgcaccgccgtcagcccgctgctccgcggcatcgaggtcggcctcgcccacggctacctcctcgtcgggcccttcgcgctcaccggcccgctccgcaacacgccggtgcacggccaggccggcgccctcggcgccgcaggcctcgtcgccatcctcagcgtctgcctcaccatgtacggcgtcgcctccttcggcgagggcgagccgtccacggcgccgacgctgacgctcaccggccgcaagaaggaggccgacaagctgcagaccgccgacggctgggccaagttcaccggcggcttcttcttcggcggcatctccggcgtcctctgggcctacttcctcctctacgtgctcgacctcccgtacttcttcaagtag。
4、另一方面，水稻光系统i亚基ospsal的氨基酸序列(seq id no:2)如下：matayapmasqlmksslvcskprglsgasltrrprftvkaiqsekptyqvvqpingdpfigsletpvtssplvawylsnlpayrtavspllrgievglahgyllvgpfaltgplrntpvhgqagalgaaglvailsvcltmygvasfgegepstaptltltgrkkeadklqtadgwakftggfffggisgvlwayfllyvldlpyffk*。
5、另一方面，本发明涉及水稻光系统i亚基ospsal基因在抗纤细病毒属、抗呼肠孤病毒科(reoviridae)、斐济病毒属(fijivirus)作物育种特别是禾本科粮食作物育种中的应用；
6、在一些实施方案中，所述纤细病毒属病毒(tenuiviruses)包括稗草白叶病毒(echinochloa hoja blanca virus，ehbv)、玉米条纹病毒(maize stripe virus，mspv)、水稻草状矮化病毒(rice grassy stunt virus，rgsv)、水稻白叶病毒(rice hoja blancavirus，rhbv)、水稻条纹病毒(rice stripe virus，rsv)、尾粰草白叶病毒(urochloa hojablanca virus，uhbv)。所述斐济病毒属(fijivirus)包括玉米粗缩病毒(maize roughdwarf virus，mrdv)、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus，rbsdv)、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus，srbsdv)；
7、在一些实施方案中，所述纤细病毒属病毒优选水稻条纹病毒。所述斐济病毒属最优选南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒。
8、在一些实施方案中，本发明涉及一种所述水稻光系统i亚基ospsal基因在抗水稻条纹叶枯病和/或抗南方水稻黑条矮缩病毒水稻育种中的应用。
9、在一些实施方案中，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选日本晴；
10、在一些实施方案中，所述负调控ospsal基因的表达是通过crispr/cas9系统实现的；所述crispr/cas9系统的靶标如seq id no:3所示，具体如下：atcaatggcgaccccttcatcgg。
11、另一方面，本发明涉及一种抗水稻条纹叶枯病转基因植物的制备方法，其步骤包括：
12、1)水稻ospsal敲除载体构建；
13、2)水稻遗传转化、农杆菌转化与愈伤组织诱导培养
14、3)阳性转基因植株的鉴定；
15、在一些实施方案中，所述水稻ospsal敲除载体构建步骤进一步包括：
16、根据seq id no:1所示的ospsal的序列在crispr-ge网站(http://skl.scau.edu.cn/)设计引物，从水稻中克隆出基因sgrna片段，将pcr产物胶回收；以pylsgrna-osu3载体为模板，将靶点序列分别连接到u3启动子和grna scaffold上。将pcr得到的两个产物混合作为模板，用重叠pcr(overlapping pcr)将u3启动子、靶点序列和grnascaffold连接在一起组成sgrna表达盒。混合grna表达盒产物和未切割的pylcrispr/cas9pubi-h质粒，用bsai在37℃对它们进行15min酶切。酶切后加入1.5μl 10×dna ligasebuffer和35u t4 ligase，用变温循环酶切连接15个循环，循环程序为37℃5min；10℃5min，20℃5min。挑选阳性克隆，测序，确认已成功构建表达载体yl-hu-ospsal。获得重组质粒，1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量。
17、在一些实施方案中，所述水稻遗传转化、农杆菌转化与愈伤组织诱导培养的步骤进一步包括：
18、愈伤组织诱导：首先挑选成熟水稻种子，剥离颖壳，倒入离心管中，加入75％乙醇进行消毒3分钟，然后倒掉乙醇，用无菌水冲洗三遍，再加入15ml 30％次氯酸钠进行消毒20分钟，之后倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍；使用移液枪吸去多余的水分，将种子转移到诱导培养基上，放于28℃光照培养箱培养3周，将长出的愈伤组织，用提前灭菌的镊子夹到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养1周；
19、农杆菌的转化和培养：将含有目的载体的质粒转化根瘤农杆菌gv3101，采用以下步骤：取5μl质粒加到100μl的农杆菌感受态中，使用移液枪吹打混匀，加入到无菌并且提前4℃预冷的电极杯中，利用电击法在220v的电压下进行电击转化，加入无抗性的lb液体培养基，28℃恒温摇床震荡培养2小时左右，涂布在含50μg/ml kan及50μg/ml rif的lb固体培养基上，28℃黑暗培养2天至出现单菌落。
20、农杆菌转染：用移液枪吸取侵染液将平板上的农杆菌冲洗下来即共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。挑选足够数量的愈伤组织，放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液，室温放置侵染20分钟，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。
21、筛选培养：共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1ml的枪头将共培养基上的愈伤拨到已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两遍，第三遍用含有500μl/l羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上，利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30分钟左右，待愈伤吹干后转移到含有潮霉素b的培养基上进行筛选培养，培养条件28-30℃，筛选时长3-4周。
22、幼苗生根：待分化出的幼苗长到2-3cm左右，有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基上生长，生根培养基要倒在较高的瓶子或管子里，生根后的苗子才有足够的空间长高，生根培养条件28-30℃，无菌光照培养。
23、在一些实施方案中，所述阳性转基因植株的鉴定的步骤进一步包括：取t0代和t1代单株幼叶，提取dna，用靶点特异性引物扩增sgrna靶向位点，进行1％凝胶电泳检测扩增产物，胶回收条带特异并且大小正确的片段，进行测序。命名为ospsal-ko(ospsal-1#和ospsal-2#)，证明转基因水稻品系构建成功。
24、在一些实施方案中，所述阳性转基因植株的鉴定的步骤进一步包括：
25、通过人工接种rsv、srbsdv来检验过表达突变体ospsal-ko转基因株系对水稻条纹病毒病和南方水稻黑条矮缩病毒病的抗性。
26、在一些实施方案中，所述诱导培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、ph＝5.8。
27、在一些实施方案中，所述继代培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
28、在一些实施方案中，所述生根培养基包含：1/2ms 39.45g/l、0.5mg/l naa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
29、在一些实施方案中，所述共培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、200μmol/l乙酰丁香酮、ph＝5.2。
30、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
31、本发明通过构建yl-hu-ospsal载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种(例如：日本晴)中，获得可稳定遗传的两个转基因水稻，分别命名为ospsal-1#和ospsal-2#。并检测其对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性分析，有助于加深我们对水稻病毒的理解和认识，丰富水稻与rsv、srbsdv相互作用的分子机制。从产业应用角度，实验结果表明：接种rsv或者srbsdv的ospsal突变体转基因植株，包括发病植株的症状及病毒在rna水平上的表达量都显著低于感病野生对照nip植株。由此可见，ospsal突变体转基因水稻能显著增强水稻对rsv或者srbsdv侵染的抗性；ospsal突变体植株在转基因领域具有很好的应用价值。本发明对培育抗水稻条纹叶枯病和南方水稻黑条矮缩病毒的转基因植物具实际指导意义，对植物病害防治领域也有重要的应用前景。
1.水稻光系统i亚基ospsal基因在抗水稻条纹叶枯病毒和抗南方水稻黑条矮缩病毒水稻育种中的应用，所述基因序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述的应用，编码所述ospsal基因的蛋白序列如seq id no:2所示。
3.权利要求1-2任一项所述的应用，通过负调控ospsal基因的表达来增加水稻针对水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)和南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice blackstreaked dwarf virus，srbsdv)的抗性。
4.权利要求3任一项所述的应用，所述负调控ospsal基因的表达是通过crispr/cas9系统实现的；所述crispr/cas9系统的靶标如seq id no:3所示。
5.一种抗水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)和南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus，srbsdv)转基因水稻的制备方法，其步骤包括：1)水稻ospsal基因敲除载体构建；2)水稻遗传转化、农杆菌转化与愈伤组织诱导培养；3)阳性转基因植株的鉴定。
6.权利要求5所述的方法，所述水稻ospsal基因敲除载体构建包括以下步骤：
7.权利要求6所述的方法，所述引物序列如下：
8.一种提高水稻对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒抗性的方法，利用crispr/cas9技术靶向编辑水稻光系统i亚基ospsal基因，所述ospsal基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。
9.一种sgrna，其靶序列结合区如seq id no:3所示。
