本发明涉及生物基因工程重组，具体涉及一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法。
背景技术：
1、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)为疱疹病毒科β属的双螺旋dna病毒，在妊娠期前后感染往往导致严重不良后果，如流产、发育畸形等，严重危害人类优生优育。随着社会发展和科技进步，建立人巨细胞病毒快速、敏感、特异的检测方法并采取早期的治疗措施，对优生、优育及控制人巨细胞病毒的传播的意义尤显重要。
2、hcmv临床检测方法以免疫学检测为主，其通过免疫学方法检测人体血清中的hcmv-igg/igm抗体，用于hcmv感染的辅助诊断、免疫状态的评估及医疗措施的制定。目前，我国食品药品监督管理局批准注册的hcmv抗体检测试剂盒种类很多，但国产试剂盒和进口试剂盒检测结果在灵敏度、特异性上还是有很大差距，有两大主要原因：一是反应体系，二是所采用的抗原，而所采用的抗原是体外诊断试剂盒开发的基础，只有抗原的特异性和亲和力都高的情况下，优化检测体系才有意义。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，可以得到一种具有高特异性和亲和力的hcmv重组嵌合抗原，该抗原可应用于国内人巨细胞病毒诊断试剂的开发和生产，减少临床检测中的假阳性、假阴性和交叉反应，提高检出率和准确率。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
3、一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，包括如下步骤：
4、s1、设计含有hcmv病毒的pp150蛋白(ul32)的aa595-614和aa951-1048、含有hcmv病毒的gp52蛋白(ul44)的aa202-433、含有hcmv病毒的pp65蛋白(ul83)的aa297-510、含有hcmv病毒的pp38蛋白(ul80a)的aa117-373的五个强优势抗原表位，并将五个强优势抗原表位通过柔性linker(ggc ggc ggc ggc agc)串联在pet32a表达质粒的kpn i/xhol i酶切位点，然后通过生物学软件对目的基因片段序列进行大肠杆菌偏爱密码子分析，将核酸序列转换为大肠杆菌偏爱同义密码子，得到优化后的基因序列，该优化后的基因序列如seq idno:1所示；
5、s2、将优化后的基因序列插入到pet32a质粒的kpn i/xho i酶切位点进行基因重组，构建获得hcmv/pet32a质粒；
6、s3、将hcmv/pet32a质粒转化到bl21(de3)表达菌中，构建表达菌cmv/pet32a/bl21(de3)；
7、s4、进行表达菌cmv/pet32a/bl21(de3)的iptg诱导表达，收集菌体；
8、s5、将收集的全菌菌体进行裂解变性；
9、s6、镍柱亲和纯化；
10、s7、透析复性，收获hcmv重组抗原。
11、进一步地，所述的步骤s5中，将收集的全菌菌体，按质量体积比为1：15～1：30加入裂解液，裂解液组分为6m盐酸胍或8m脲+20mm pb+1～3mm咪唑+1～3mm dtt，ph＝8.0，冰浴下超声破碎，输出功率90％，工作3s，间隔5s，超声20～30min后，10000～12000rpm离心30min收集上清，0.22μm滤膜过滤除菌。
12、进一步地，所述的步骤s6中，包括：
13、(1)ni-nta镍柱走纯化水10～20个柱体积；
14、(2)裂解液平衡10～20柱体积至基线走平；
15、(3)低温循环上样1～3h；
16、(4)以8m脲+20mm pb+5～10mm咪唑+1mm2-me为洗涤液，洗涤10～20柱体积；
17、(5)以8m脲+20mm pb+250～400mm咪唑+1mm2-me为洗脱液，洗脱10个柱体积，收集洗脱峰，即为变性的hcmv纯化抗原。
18、进一步地，所述的步骤s7中，将洗脱峰样本装入截留量10～30kd的透析袋，置于20～50倍体积的复性液中，4℃静置透析过夜，日用无gsh/gssg的复性液进行二次透析，磁力搅拌3～5h换一次液，第3次换液后4℃静置过夜，充分透析。
19、进一步地，所述的复性液为：20mm tris+1mm edta+50～100mm脲+0.2mm gsh+0.1mm gssg+2％～5％甘油，ph＝8.5。
20、进一步地，所述的步骤s7中，收集透析袋中液体，10000～12000rpm离心20min弃沉淀收上清，0.22μm过滤除菌，分装后冷冻保存于-80℃或者冻干保存。
21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22、本发明将人巨细胞病毒(hcmv)五片段优势表通过串联方式采用柔性linker连接，利用原核表达系统表达出具有高特异性和亲和力的hcmv重组嵌合抗原，该抗原完全自主设计，生产纯化成本低廉、特异性强、灵敏度高，可应用于国内人巨细胞病毒诊断试剂的开发和生产，减少临床检测中的假阳性、假阴性和交叉反应，提高检出率和准确率。
23、本发明制备的hcmv五优势表位的嵌合抗原，诱导表达量高，易于纯化和复性，且复性率较高，经检测临床样本对其抗原性评价，特异度达到100％，灵敏度和准确的均能够达到99％以上，能够达到进口检测试剂水平，极具应用价值。
1.一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的优化后的基因序列如seq id no:1所示。
3.如权利要求1所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的步骤s5中，将收集的全菌菌体，按质量体积比为1：15～1：30加入裂解液，裂解液组分为6m盐酸胍或8m脲+20mm pb+1～3mm咪唑+1～3mm dtt，ph＝8.0，冰浴下超声破碎，输出功率90％，工作3s，间隔5s，超声20～30min后，10000～12000rpm离心30min收集上清，0.22μm滤膜过滤除菌。
4.如权利要求1所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的步骤s6中，包括：
5.如权利要求1所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的步骤s7中，将洗脱峰样本装入截留量10～30kd的透析袋，置于20～50倍体积的复性液中，4℃静置透析过夜，日用无gsh/gssg的复性液进行二次透析，磁力搅拌3～5h换一次液，第3次换液后4℃静置过夜，充分透析。
6.如权利要求5所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的复性液为：20mm tris+1mm edta+50～100mm脲+0.2mm gsh+0.1mmgssg+2％～5％甘油，ph＝8.5。
7.如权利要求5所述的一种人巨细胞病毒多优势表位重组嵌合抗原的构建及纯化方法，其特征在于：所述的步骤s7中，收集透析袋中液体，10000～12000rpm离心20min弃沉淀收上清，0.22μm过滤除菌，分装后冷冻保存于-80℃或者冻干保存。
