本实施方式涉及特异性结合分化簇71(cd71)的纤维粘连蛋白iii型结构域(fn3)以及制备和使用这些分子的方法。
背景技术：
1、cd71(也称为转铁蛋白受体1)是跨膜的，对于铁转运到细胞中至关重要。它在许多肿瘤类型上和血脑屏障处高度表达，因此已成为用于药物递送的重要靶标。在与负载铁的转铁蛋白结合后，cd71被迅速内吞并有效地循环回细胞表面。对cd71抗体药物缀合物的研究表明，靶向cd71可以改善药物递送的特异性和选择性，并扩大治疗指数。此外，使用抗cd71单克隆抗体的研究表明，结合亲和力可能在实现血脑屏障转胞吞作用中发挥重要作用。对cd71具有高亲和力的抗体会被迅速内化并改变正常的受体运输，因此受体不会再循环，而是靶向溶酶体进行降解。相比之下，对cd71具有低亲和力的抗体允许受体再循环和更高的脑暴露。
2、虽然当需要对靶分子具有高亲和力和特异性时，抗体或抗体片段是最广泛使用的治疗蛋白类型，但非抗体蛋白也可以被设计成与这些靶标结合。这些“替代支架”蛋白具有优于传统抗体的优势，因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高、能够在原核宿主中表达、易于纯化，并且它们易于与药物/毒素缀合，有效渗透到组织中并且易于格式化成多特异性粘结剂。
3、一种这样的替代支架是免疫球蛋白(ig)折叠。这种折叠存在于抗体的可变区以及数以千计的非抗体蛋白中。已经表明，一种这样的ig蛋白(来自人纤维粘连蛋白的第十个纤维粘连蛋白iii型(fn3)重复)，可以耐受表面暴露环中的许多突变，同时保留整体ig折叠结构。因此，需要可以特异性结合cd71的fn3结构域，以及使用这种分子进行癌症治疗的方法。
技术实现思路
1、在一些实施方式中，提供了特异性结合cd71蛋白的fn3结构域(例如多肽)。在一些实施方式中，所述fn3结构域是分离的。在一些实施方式中，所述fn3结构域是重组的。在一些实施方式中，所述fn3结构域是非天然存在的。
2、在一些实施方式中，提供了包括seq id no:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62的氨基酸序列的fn3结构域。在一些实施方式中，提供了包括seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的氨基酸序列的fn3结构域。在一些实施方式中，提供了包括seq id no:81-309的氨基酸序列的fn3结构域：在一些实施方式中，所述fn3结构域与cd71结合。在一些实施方式中，所述fn3结构域在cd71上不与转铁蛋白竞争结合cd71的位点处与人cd71结合。在一些实施方式中，提供了包括seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149的氨基酸序列的fn3结构域。在一些实施方式
3、中，所述fn3结构域与cd71特异性结合。在一些实施方式中，提供了包括通过接头(例如柔性接头)连接的多于一个fn3结构域的所述多肽。在一些实施方式中，所述多肽包括2、3或4个fn3结构域，这些结构域通过所述结构域之间的一个或多个接头彼此连接。
4、在一些实施方式中，提供了编码本文所述的fn3结构域的分离的多核苷酸。
5、在一些实施方式中，提供了包括本文所述的多核苷酸的载体。
6、在一些实施方式中，提供了包括本文所述的载体的宿主细胞。
7、在一些实施方式中，提供了产生所述fn3结构域的方法。在一些实施方式中，该方法包括培养包括编码或表达所述fn3结构域的载体的宿主细胞。在一些实施方式中，该方法还包括纯化所述fn3结构域。在一些实施方式中，所述fn3结构域特异性结合cd71。
8、在一些实施方式中，提供了包括与cd71结合的fn3结构域和药学上可接受的载体的药物组合物。
9、在一些实施方式中，提供了结合与cd71结合的fn3结构域的抗独特型抗体。
10、在一些实施方式中，提供了包括一个或多个fn3结构域的试剂盒。
11、在一些实施方式中，提供了检测肿瘤组织中表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括从受试者获得所述肿瘤组织的样品并通过使所述肿瘤组织的所述样品与包括seq id no:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结
12、合cd71蛋白的所述fn3结构域接触以及检测cd71蛋白与所述fn3结构域之间的结合来检测所述肿瘤组织中是否表达cd71蛋白。
13、在一些实施方式中，提供了分离表达cd71的细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括从受试者获得样品；使所述样品与包括seq id no:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结合cd71蛋白的所述fn3结构域接触以及分离与所述fn3结构域结合的所述细胞。
14、在一些实施方式中，提供了检测肿瘤组织中表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括使包括seq id no:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309中之一的氨基酸序列的结合cd71蛋白的fn3结构域与可检测标记缀合以形成缀合物；向受试者给药所述缀合物；以及使与所述缀合物结合的表达cd71的癌细胞可视化。
15、在一些实施方式中，提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法。在一些实施方式中，该方法包括给药与cd71结合的多肽。在一些实施方式中，所述多肽是与cd71结合的fn3结构域。在一些实施方式中，所述多肽包括与治疗剂联接或缀合的包括诸如seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
16、57、58、59、60、61、62或81-309的序列或如本文所提供的多肽。
17、在一些实施方式中，提供了治疗神经病症和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者给药本文提供的多肽或所述药物组合物。在一些实施方式中，所述脑肿瘤选自由非恶性、良性和恶性脑肿瘤组成的组。
18、在一些实施方式中，提供了将目标药剂递送至cd71阳性细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞与偶联至结合cd71的fn3结构域(例如本文提供的多肽)的目标药剂接触。在一些实施方式中，所述目标药剂是化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、sirna分子、反义分子、rna分子、dna分子、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。
19、在一些实施方式中，所述多肽是在不竞争或抑制转铁蛋白与cd71结合的位点处与cd71结合的fn3蛋白。
20、在一些实施方式中，提供了鉴定在不竞争或抑制转铁蛋白与cd71结合的位点处与cd71结合的fn3蛋白的方法。
1.一种包括与以下氨基酸序列至少90％的氨基酸序列的多肽：seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309或其任何组合；或一种包括以下氨基酸序列的多肽：seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309或其任何组合。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括以下中的两种：seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85、149、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或81-309。
3.一种多肽，其在cd71上不与转铁蛋白竞争结合cd71的位点处与人cd71结合。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽包括与具有以下序列的多肽至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、{goodw-24007-cndiv/01993881v1}1
5.根据权利要求3所述的多肽，其中所述多肽包括以下序列：seq id no:146、214、104、259、134、92、302、235、237、152、238、136、197、212、296、226、261、307、115、112、278、297、96、222、95、233、217、252、194、164、168、174、190、257、303、284、85或149。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述多肽与可检测标记、寡核苷酸、治疗剂或其任何组合缀合。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。
8.根据权利要求6或7所述的多肽，其中所述可检测标记是奥瑞他汀、单甲基奥瑞他汀苯丙氨酸、多拉司他汀、化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。
9.根据权利要求6所述的多肽，其中所述治疗剂是化疗剂、药物、抗体、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、sirna分子或其有义或反义链、反义分子或其链、rna分子、dna分子、dna小沟结合物、dna复制抑制剂、烷化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢药、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。
10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述治疗剂可以通过调节基因表达、rna表达或水平、微管蛋白结合、dna结合、拓扑异构酶抑制、dna交联、螯合、剪接体抑制、nampt抑制、或hdac抑制而引起一种或多种细胞毒性作用。
