本发明属于分子生物，具体涉及一种基于功能核酸分子的加帽修饰方法及应用。
背景技术：
1、基因治疗能够通过特异性靶向组织中特定细胞的特定基因、剪接mrna前体、修复有缺陷的rna、或以酶依赖或酶独立的方式恢复基因功能，实现高效地调控编码和非编码靶基因目的，对癌症、病毒感染、遗传疾病等多种人类疾病具有广泛的治疗前景，是精准医疗的重要治疗策略之一。功能核酸作为新一代基因治疗策略的候选结构，主要包括反义寡核苷酸、核酶和脱氧核酶、小干扰rna、各种mirna抑制剂、核酸适配体等，具有特异性强、作用效率高、免疫原性低、应用范围广等特点，日益显示出重要作用，具有潜在临床应用前景。
2、具有催化功能的核酸是一种具有酶活性的特殊核酸分子，它可以像蛋白酶一样催化诸如水解、酯基转移、连接等反应。具体包括各种rna(例如hammerhead核酶(锤头核酶)、hairpin核酶、hdv核酶、twister核酶、twister sister核酶、pistol核酶(手枪核酶)、groμpi intron、groμp ii intron、dnazyme、xnazyme、脱氧核酶、内含子、剪切体)、脱氧核酶(dnazyme)|xnazyme以及其他各种天然的或者人工筛选获得的具有催化功能的核酸分子。其中锤头核酶曾经作为一种代表性的具有催化功能的核酸用于小核酸药物的开发研究中。然而，由于其在细胞内的稳定性、催化活性与在体外有较大差异等原因，使得基于核酶的小核酸药物的生物医药开发工作偃旗息鼓。
3、核酸药物分子在结构上与内源性核酸分子无异，极易被各种内核酸酶和外核酸酶所降解，其核糖磷酸骨架结构具有负电性，极性大，不能完全满足作为一个药物使用的基本条件，肾脏清除迅速和较差的药代动力学特性等缺点也会使基于基因的核酸类药物治疗发展受限。因此通过对核酸药物进行多种修饰，对于优化性能，提高其在生物体内的稳定性至关重要。
4、研究发现5′端帽子结构可以调节mrna的剪切成熟，并帮助rna转录产物穿过核膜的选择性孔道进入细胞质而避免通过细胞先天免疫机制的mrna识别。此外，5′帽子结构还可以保护mrna不被核酸外切酶降解，稳定和改善其编码的蛋白质的翻译，因此帽子结构(cap)对于mrna来说至关重要。现有技术中帽类似物结构多应用于针对mrna的修饰研究方面，迄今为止尚未有将这种加帽修饰应用于其他功能核酸的先例或更有针对性的应用于具有催化功能的核酸修饰的先例。鉴于非mrna的功能核酸，包括具有催化功能的核酸与mrna的组成具有相似性，因此5’端帽子结构也可以对具有催化功能的核酸进行加帽修饰，这种修饰对于具有催化功能的核酸分子的化学和物理性质带来变化。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对具有催化功能的核酸修饰方法：使用帽结构及其类似物对具有催化功能的核酸进行5′端的加帽修饰。所述帽结构修饰的功能核酸具有以下优势：(1)体外酶切效率较高；(2)在体外具有较长的半衰期，且在模拟血清环境中降解速率较慢；(3)在细胞内能够实现高效的降解靶标基因的活性；(4)在动物体上表现出比未修饰的、或者经过其他方式修饰的相同核酸序列体现出更好的肿瘤靶向抑制效果。
2、本发明采用如下技术方案：以kras、pdl1、alas1等基因mrna序列作为代表性靶标、以靶向相应基因的手枪核酶作为代表性具有催化功能的核酸分子进行加帽修饰。通过体外酶活测定、细胞实验、动物实验验证了这种加帽修饰对提高具有催化功能的核酸的活性和稳定性具有显著的提升作用。
3、所述功能核酸分子特征为，基本组合方式为式1：
4、
5、其中，
6、r为
7、x1、x2为天然的、非天然的或修饰的核苷碱基a、u、c、g中的任一种；
8、r1、r2、r3为o或s；
9、r4、r5可分别独立或同时为h、oh或o-ch3；
10、优选地，
11、r为
12、x1、x2为天然的核苷碱基a、u、c、g中的一种；
13、r1、r2、r3为o；
14、r4为oh；
15、r5为oh；
16、优选地，所述的rna/dna为一种功能核酸分子，主要包括pistol核酶及衍生结构等。
17、优选地，所述的功能核酸分子自身或者通过结合配体之后具备靶向识别和降解靶标的核酸分子及其各类化学修饰的衍生物。
18、优选地，所述的功能核酸分子特征在于：其5′末端为5′-三磷酸的单链rna分子，或者经过化学修饰或者磷酸化反应，可以形成5′-三磷酸结构。
19、优选地，核酶如seq id no.1中的序列所示；
20、优选地，核酶能够特异性识别并通过碱基互补配对的方式酶切突变型kras g12v基因mrna，在体外酶活测定中体现更加高效稳定的酶切性质，在细胞内和动物体内能够更好的抑制kras基因的表达。
21、优选地，核酶加帽后在细胞内对基因pdl1和alas1的抑制活性更高。
22、优选地，所述的具有催化功能的核酸分子的加帽修饰制备方法包括步骤：
23、(1)以手枪核酶为例，通过转录方式制备手枪核酶分子；
24、(2)以cap0帽子为例，使用帽结构cap0对制备的手枪核酶进行加帽反应。
25、优选地，所述的加帽修饰的手枪核酶在体外和体内的验证实验及应用中具备相对于未经修饰的相同手枪核酶序列具备更好的的靶向抑制kras g12v基因mrna靶标的功效。
1.一种加帽修饰的具有催化功能的核酸分子，其特征为，基本组合方式为式1：
2.根据权利要求1所述的功能核酸分子，其特征在于：为以核苷酸为基本单位组成的具有催化功能的生物大分子，通过碱基互补配对的方式识别核酸靶标，并在特定的位点对靶标序列进行酶切造成核酸靶标序列断裂，从而实现对靶标的降解和功能的抑制。
3.权利要求2所述的具有催化功能的生物大分子为一种功能核酸分子，其特征在于，包括hammerhead核酶(锤头核酶)、hairpin核酶、hdv核酶、twister核酶、twister sister核酶、pistol核酶(手枪核酶)、groμp i intron、groμp ii intron、dnazyme、xnazyme、脱氧核酶、内含子、剪切体等所有本身或者通过结合配体之后具备靶向识别和降解靶标的核酸分子及其各类化学修饰的衍生物。
4.根据权利要求2所述的功能核酸分子，其特征在于：其结构的5′末端为5′-三磷酸的单链rna或dna分子。
5.根据权利要求1-4所述的功能核酸分子，其中该核酸序列包含一种或多种化学修饰，修饰部位包括但不限于碱基、核糖及磷酸基团。
6.根据权利1所述的功能核酸分子的加帽修饰制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下：
7.权利要求1-6中任一所述的加帽修饰功能核酸分子在细胞内外靶向抑制rna分子的应用。
