本技术涉及生物，尤其涉及一种土曲霉启动子文库及其筛选方法与应用。
背景技术：
1、土曲霉是一种具有重要经济价值的工业丝状真菌，在生产初级代谢产物和次级代谢产物上都表现出了极大潜力。同时在实际生产中还表现出发酵周期短、产孢能力强、抗逆性能好、发酵鲁棒性强等良好的工业性能，已被应用于衣康酸、洛伐他汀、反式乌头酸和大黄素甲醚细胞工厂构建并实现了工业化生产。
2、随着代谢工程和合成生物学的发展，相应的多种方法已被开发用于微生物高滴度生产目标产物，其中启动子工程已成为调控基因表达并优化目标产物生物合成途径的关键技术，并广泛应用于微生物的代谢工程改造。启动子是调控基因表达的重要元件，其位于结构基因5’端上游非编码区，是rna聚合酶特异性识别和结合的dna片段。启动子的活性受到多种因素的影响，而在基因的异源表达中，常常需要根据实际需求选择不同活性的启动子。
3、虽然目前已经报道了许多来源的各式启动子以及启动子文库，但未有针对土曲霉的启动子筛选技术，并且许多外源启动子在土曲霉工程菌中存在适应性差的问题。因此，为了满足后续代谢工程改造的需求，本发明构建了土曲霉自身启动子文库并进行筛选。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明的目的是提供一种土曲霉启动子文库的构建及启动子的筛选方法和应用，以期筛选获得不同强度的土曲霉来源的启动子并构建启动子文库。
2、一方面，本技术提供了一种土曲霉启动子文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
3、步骤一、将待构建启动子与报告基因依次连接获得重组表达盒；所述待构建启动子来源于土曲霉；
4、步骤二、将重组表达盒转入工程菌色素合成相关基因位点，构建重组工程菌，即获得启动子文库。
5、优选的，所述待构建启动子来源于土曲霉g2和/或土曲霉mefc01。
6、本技术中选择土曲霉g2和土曲霉mefc01基因组进行启动子筛选的目的为选择产反式乌头酸的土曲霉和产衣康酸的土曲霉作为筛选样本，能够使得筛选获得的启动子更适用于产有机酸的土曲霉工程菌中，适于后续的有机酸生产过程。
7、可以理解的是，本领域技术人员也可以根据不同需求选择其他合成途径相关工程菌基因组进行筛选，本技术中在此不做具体限制。
8、进一步地，所述重组表达盒还包括色素合成相关基因的同源臂；优选的，所述重组表达盒还包括色素合成相关基因上游同源臂和色素合成相关基因下游同源臂。
9、优选的，所述色素合成相关基因的同源臂的长度大于1.0kb。
10、更优选的，所述色素合成相关基因的同源臂的长度为1.0-1.5kb。
11、在一种优选的实施方式中，所述色素合成相关基因上游同源臂的序列如seq idno.32所示，色素合成相关基因下游同源臂如seq id no.33所示。
12、其中，同源臂的作用为辅助重组表达盒转入工程菌色素合成相关基因位点，以确保正确插入特定位点。
13、进一步地，所述工程菌包括曲霉属菌株；更优选的，选自土曲霉、黑曲霉、巢曲霉、烟曲霉、米曲霉中的一种或多种；优选的，所述工程菌为土曲霉。
14、在一种优选的实施方式中，所述土曲霉为土曲霉mefc01。
15、进一步地，所述色素合成相关基因包括pgma基因、mela基因和/或treta基因；更优选的，所述色素合成相关基因包括mela基因。
16、其中，tera基因的gene bank号为ateg_00145；pgma基因的gene bank号为ateg_06206；mela基因的gene bank号为ateg_03563。
17、本技术中首次将启动子插入色素合成相关基因位点，实现色素合成相关基因的定点敲除过程，即导致色素合成相关基因的失活，其失活后可通过菌落颜色发生明显改变，因此操作人员可以直接根据菌落颜色的变化直接筛选重组工程菌，大大提高了文库构建效率。
18、进一步地，所述报告基因选自荧光素酶报告基因、荧光标记基因、抗性基因中的一种或多种；优选的，所述报告基因包括荧光素酶报告基因。
19、在一种优选的实施方式中，所述荧光素酶报告基因为luc基因。
20、优选的，所述荧光素酶报告基因的核苷酸序列如seq id no.29所示。
21、进一步地，所述重组表达盒还包括终止子。
22、在一种优选的实施方式中，所述终止子为tpgk，所述终止子的核苷酸序列如seqid no.30所示。
23、本领域技术人员可以理解的是，可选择任意终止子构建上述重组表达盒，只要终止子能够起到终止报告基因表达的功能即可，本技术在此处不做过多的限制。
24、本领域技术人员能够想到，在本技术所述重组表达盒的基础上可适应性添加其他常用表达元件辅助目的基因的表达，如添加标签、荧光蛋白标记、抗性筛选标记等。
25、在一种优选的实施方式中，重组表达盒中含有抗性筛选标记基因，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，本技术中不对抗性筛选标记基因进行强制性的限定。所述抗性筛选标记基因可为hph基因，hph基因的核苷酸序列如seq id no.31所示。
26、在一种优选的实施方式中，所述重组表达盒依次包括：待构建启动子、报告基因、终止子、抗性筛选标记基因。
27、进一步地，所述将重组表达盒引入土曲霉的方法选自原生质体转化法、电转化法、基因枪法、农杆菌介导法中的一种；优选的，原生质体转化法。
28、对于本领域技术人员而言可以理解，可以采用现有的基因编辑技术完成上述表达盒及重组工程菌的构建。
29、在一种优选的实施方式中，一种土曲霉启动子文库的构建方法，所述方法包括：
30、步骤一、自土曲霉基因组中获得待构建启动子，将待构建启动子、报告基因、终止子、抗性筛选标记基因依次连接获得重组表达盒；
31、步骤二、将重组表达盒转入工程菌色素合成相关基因位点，构建重组工程菌，即获得启动子文库。
32、另一方面，本技术还提供了一种土曲霉启动子的筛选方法，所述方法包括：
33、步骤一、将待构建启动子与报告基因依次连接获得重组表达盒；所述待构建启动子来源于土曲霉；
34、步骤二、将重组表达盒转入工程菌色素合成相关基因位点，构建重组工程菌；
35、步骤三、检测重组工程菌中报告基因表达水平。
36、在一种优选的实施方式中，一种土曲霉启动子的筛选方法，所述方法包括：
37、步骤一、自土曲霉基因组中获得待构建启动子，将待构建启动子、荧光素酶报告基因、终止子、抗性筛选标记基因依次连接获得重组表达盒；
38、步骤二、将重组表达盒转入工程菌色素合成相关基因位点，构建重组工程菌；
39、步骤三、检测重组工程菌与底物反应所发出的荧光信号。
40、其中，利用酶标仪检测荧光信号能够反映荧光素酶报告基因的活性和表达水平，进而体现启动子的表达强度，即实现了启动子的筛选。
41、在一种优选的实施方式中，所述重组工程菌的报告基因表达量与对照组进行比对，将其根据与对照组的表达量差异分为低表达、中表达和高表达组，方便本领域技术人员根据需求获取对应的启动子。
42、另一方面，本技术还提供了一种所述的筛选方法获得的土曲霉启动子。
43、在一种优选的实施方式中，所述土曲霉启动子包括seq id no.1-seq id no.27任一序列。
44、其中，低表达启动子包括pg7031、pg2820、pg8803、pg5035、pg2000，中表达启动子包括pg3329、pg1220、pg5630、pg8690、pg6920、pg1404、pg6796、pg3561、pg9110、pg6114、pg5571、pg4602、pg2710、pg10239、pg6323、pg1175、pg2319、pg7765、pg7389、pg6906、pg1297、pg6625，高表达启动子包括pg6550、pg6756、pg6669。
45、其中，pg5630的核苷酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1具有至少98％的同一性。
46、pg1404的核苷酸序列如seq id no.2所示或与seq id no.2具有至少98％的同一性。
47、pg6114的核苷酸序列如seq id no.3所示或与seq id no.3具有至少98％的同一性。
48、pg6669的核苷酸序列如seq id no.4所示或与seq id no.4具有至少98％的同一性。
49、pg6550的核苷酸序列如seq id no.5所示或与seq id no.5具有至少98％的同一性。
50、pg2000的核苷酸序列如seq id no.6所示或与seq id no.6具有至少98％的同一性。
51、pg6625的核苷酸序列如seq id no.7所示或与seq id no.7具有至少98％的同一性。
52、pg7765的核苷酸序列如seq id no.8所示或与seq id no.8具有至少98％的同一性。
53、pg6756的核苷酸序列如seq id no.9所示或与seq id no.9具有至少98％的同一性。
54、pg6906的核苷酸序列如seq id no.10所示或与seq id no.10具有至少98％的同一性。
55、pg8803的核苷酸序列如seq id no.11所示或与seq id no.11具有至少98％的同一性。
56、pg2399的核苷酸序列如seq id no.12所示或与seq id no.12具有至少98％的同一性。
57、pg7389的核苷酸序列如seq id no.13所示或与seq id no.13具有至少98％的同一性。
58、pg2710的核苷酸序列如seq id no.14所示或与seq id no.14具有至少98％的同一性。
59、pg9110的核苷酸序列如seq id no.15所示或与seq id no.15具有至少98％的同一性。
60、pg6920的核苷酸序列如seq id no.16所示或与seq id no.16具有至少98％的同一性。
61、pg1297的核苷酸序列如seq id no.17所示或与seq id no.17具有至少98％的同一性。
62、pg6323的核苷酸序列如seq id no.18所示或与seq id no.18具有至少98％的同一性。
63、pg5035的核苷酸序列如seq id no.19所示或与seq id no.19具有至少98％的同一性。
64、pg4602的核苷酸序列如seq id no.20所示或与seq id no.20具有至少98％的同一性。
65、pg7031的核苷酸序列如seq id no.21所示或与seq id no.21具有至少98％的同一性。
66、pg8690的核苷酸序列如seq id no.22所示或与seq id no.22具有至少98％的同一性。
67、pg1220的核苷酸序列如seq id no.23所示或与seq id no.23具有至少98％的同一性。
68、pg6796的核苷酸序列如seq id no.24所示或与seq id no.24具有至少98％的同一性。
69、pg3561的核苷酸序列如seq id no.25所示或与seq id no.25具有至少98％的同一性。
70、pg5571的核苷酸序列如seq id no.26所示或与seq id no.26具有至少98％的同一性。
71、pg10239的核苷酸序列如seq id no.27所示或与seq id no.27具有至少98％的同一性。
72、另一方面，本技术还提供了所述的启动子在土曲霉重组菌株中的应用。
73、本发明具有如下有益效果：
74、本技术首次提供了一种土曲霉启动子文库的构建及启动子的筛选方法，并通过该方法筛选获得不同活性的土曲霉来源的启动子为合成生物学提供了新的工具材料，并且土曲霉来源的启动子与土曲霉工程菌具有更好的适应性，解决了外源启动子转入土曲霉工程菌使用过程中的适应性差、活性低等问题。
1.一种土曲霉启动子文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组表达盒还包括色素合成相关基因的同源臂；优选的，所述重组表达盒还包括色素合成相关基因上游同源臂和色素合成相关基因下游同源臂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌包括曲霉属菌株；更优选的，选自土曲霉、黑曲霉、巢曲霉、烟曲霉、米曲霉中的一种或多种；优选的，所述工程菌为土曲霉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色素合成相关基因包括pgma基因、mela基因和/或treta基因；优选的，所述色素合成相关基因包括mela基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告基因选自荧光素酶报告基因、荧光标记基因、抗性基因中的一种或多种；优选的，所述报告基因包括荧光素酶报告基因。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组表达盒还包括终止子。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将重组表达盒引入土曲霉的方法选自原生质体转化法、电转化法、基因枪法、农杆菌介导法中的一种；优选的，原生质体转化法。
8.一种土曲霉启动子的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
9.一种权利要求8所述的筛选方法获得的土曲霉启动子。
10.权利要求9所述的启动子在土曲霉重组菌株中的应用。
