本发明涉及农药残留检测，具体涉及检测啶虫脒农药残留的分子标记组、引物及检测方法和应用。
背景技术：
1、对于农药残留检测，应用较广泛的是色谱法(chromatography)。在色谱分析中会使用各种高灵敏度的检测器，如：火焰光度检测器(fpd)对硫、磷具有选择性，常用来检测农作物中有机磷类的农药残留；电子俘获检测器(ecd)用于检测电负性物质，常用来检测农作物中有机氯类的农药残留。可见，色谱检测往往仅能得出目标元素在农作物中的残留情况，无法明确农药具体种类，目前有将色谱检测法与质谱检测法(mass spectrometry)联用以解决这一问题。农作物样本在进行色谱分离之前，需要经过提取、纯化、浓缩等步骤，由于不同样品中的基质和结构的差异，如脂肪含量高低、水分含量高低、叶绿素含量高低等，提取所用的溶剂必须不同，这导致不同的样本有各自适宜的提取溶剂体系，该方法的普遍性、推广性有所欠缺；另由于目标提取农药的不同，提取溶剂、提取方法的选择相应变动，该方法每次仅能检测某类农药，对于多类农药综合施用的情况排查效率低下。
2、酶抑制法(enzyme inhibition)常利用农药对农作物乙酰胆碱酯酶(ache)的抑制作用，通过酶促底物反应中显色的程度来确定检测样品中的农药残留量。ache对有机磷农药较敏感，测定的灵敏度高，选择性强，但价格昂贵，而且部分农药对其的抑制并不明显，需要附加氧化助剂或预处理，以提高对农药检测的灵敏度。免疫分析法(immunoassay)是基于蛋白抗原和抗体之间或者小分子半抗原和抗体之间的特异反应的分析方法。酶免疫分析(elisa)常用于农药残留检测，检测水平可达ng甚至pg级，但由于所用的农药抗体制备难度较大，开发费用较高，免疫分析法仅仅适用于单一种类农药残留量的分析检测，不适用于多残留分析。目前用于农药残留检测的生物传感器大多依据酶抑制法和免疫分析法设计。
3、生物传感器是一种独立的设备，它集成了识别分析物(例如酶底物、互补dna、抗原)的固定化生物元件(例如酶、dna探针、抗体)和用于将分析物与生物受体相互作用产生的(生物)化学信号转换为电子信号的转导元件。根据信号转导技术，生物传感器分为电化学、光学、压电和机械生物传感器。
4、其中，酶生物传感器在农药检测中有广泛应用。酶生物传感器的设计是基于固定化方法，即通过范德华力、离子键或共价键吸附酶，这种固定化酶消耗底物或分析物与共底物并得到产物，然后通过测量共底物消耗或产品产量来实现生物传感器的响应，或评估与固定化酶特异相互作用并抑制其生物催化特性的物质或抑制剂，这种抑制剂结合到酶或酶-底物复合物，并进一步干扰酶的反应。用于此目的常用的酶有胆碱酯酶、氧化还原酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和氨氧化酶。基于此基本流程，酶生物传感器法检测特异性差、酶底物的环境污染物数量有限、检测限高、灵敏度低(一般在20μg/kg左右)，难以对低浓度农药残留进行精确监测，往往只能起到定性监测功能。
5、啶虫脒属氯化烟碱类化合物，英文通用名为acetamiprid，其化学名称为n-(n-氰基-乙亚胺基)-n-甲基-2-氯吡啶-5-甲胺，化学式为c10h11cln4，啶虫脒是一种新型杀虫剂。是一种新型吡啶类杀虫剂，具有胃毒、触杀和较强的渗透作用，且显示速效的杀虫力，残效期长。且具有一定杀螨活性的杀虫剂，其作用方式为土壤和枝叶的系统杀虫剂。广泛用于水稻，尤其蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。以触杀和胃毒作用为主，对害虫有一定的驱避拒食作用，但无内吸及熏蒸作用。作用于昆虫神经系统突触部位的烟碱乙酰胆碱受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经系统通路阻塞，造成神经递质乙酰胆碱在突触部位的积累，从而导致昆虫麻痹，最终死亡。随着分子生物技术的发展及其广泛应用，分子标记被用于检测领域，但是灵敏度有待提高，检测啶虫脒的分子标记更是鲜有研究。
技术实现思路
1、为提供一种低检出限、高灵敏度的农药残留检测方法，本发明提供了一种检测啶虫脒农药残留的分子标记组、引物及检测方法和应用。利用本发明提供的引物组检测叶角短肛体内残留农药，nd1、nd4和nd5均显著性表达，可判定为啶虫脒存在残留。
2、本发明提供了检测啶虫脒农药残留的分子标记组，所述分子标记组为nd1、nd4和nd5的组合；
3、所述nd1的核苷酸序列如seq id no.1所示；
4、所述nd4的核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、所述nd5的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、本发明还提供了扩增所述的检测啶虫脒农药残留的分子标记组的引物，所述引物包括扩增所述nd1的引物对、扩增所述nd4的引物对和扩增所述nd5的引物对；
7、扩增所述nd1的引物对序列如seq id no.4-5所示；
8、扩增所述nd4的引物对序列如seq id no.6-7所示；
9、扩增所述nd5的引物对序列如seq id no.8-9所示。
10、本发明还提供了一种包含所述引物的检测试剂盒。
11、进一步地，所述检测试剂盒还包括总rna提取试剂、rna反转录试剂、内参基因扩增引物组、实时荧光定量pcr扩增试剂。
12、进一步地，实时荧光定量pcr扩增试剂包括rox染料和荧光染料。
13、本发明还提供了利用所述分子标记组、所述的引物或检测试剂盒检测啶虫脒农药残留的方法，包括如下步骤：
14、将待测农药与叶角短肛胁迫培养24h，以纯净水处理叶角短肛24h为对照组；
15、胁迫培养结束后提取叶角短肛rna；
16、然后以叶角短肛rna为模板，利用权利要求2所述的引物进行rt-qpcr反应；
17、若待测农药胁迫培养后nd1、nd4和nd5的表达量与对照组相比均显著上调则认为啶虫脒存在残留。
18、本发明还提供了所述的分子标记组、所述的引物或检测试剂盒在检测啶虫脒农药残留中的应用，所述啶虫脒的最低检出限为5μg/l≈5×10-3mg/kg(溶液浓度很低，密度可近似于水的密度ρ＝1kg/l)。
19、本发明还提供了所述的分子标记组、所述的引物或检测试剂盒在鉴别农残污染类型中的应用，所述农残污染类型包括啶虫脒、毒死蜱和氟氯氰菊酯。
20、进一步地，待测农药分别胁迫培养叶角短肛以纯净水培养叶角短肛为对照组，培养结束后提取叶角短肛rna为模板，分别以seq id no.4-5、seq id no.6-7和seqid no.8-9序列为引物进行rt-qpcr反应，若nd1、nd4和nd5的表达量与对照组相比均显著上调则认为啶虫脒存在残留。
21、进一步地，nd1、nd4和nd5的表达量与对照组相比均显著上调表现为：
22、nd1的表达量相比对照组上调了1.67±0.18倍，nd4的表达量相比对照组上调了1.43±0.16倍，nd5的表达量相比对照组上调了1.66±0.10倍。
23、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
24、1、本发明提供的分子标记和引物组具有低检出限、高灵敏度的优势，叶角短肛在低浓度(5μg/l)的啶虫脒农药胁迫处理下，其线粒体蛋白质编码基因nd1、nd4和nd5存在显著性表达。啶虫脒检出限为5μg/l≈5×10-3mg/kg(溶液浓度很低，密度可近似于水的密度ρ＝1kg/l)，小于食品安全国家标准中各食品类别对啶虫脒的最大残留限量。
25、2、本发明提供的检测方法具备如下优点：
26、(1)高灵敏度：线粒体作为细胞呼吸作用的重要场所，对环境变化敏感，能够迅速地对环境胁迫做出应答，线粒体对于较低浓度的农药胁迫也能做出显著性差异表达。同时荧光定量pcr对目标dna的检测非常敏感，可以在低浓度的农药残留下进行可靠的检测，从而提高了检测的灵敏度。
27、(2)实时监测：荧光定量pcr允许在反应过程中实时监测pcr产物的累积，这实时监测的特性有助于提高检测速度和准确性。
28、(3)高特异性：目标基因片段设计了特异性引物，且引入荧光探针或染料使得对pcr产物的检测更为特异，减少了非特异性反应的可能性，提高了检测的准确性。
29、(4)多重检测：荧光定量pcr可以同时检测多个线粒体基因表达情况，这对于环境中可能存在的多种农药残留进行综合检测是非常有利的。
30、(5)自动化：荧光定量pcr可以与自动化设备结合，实现高通量的农药残留检测，提高了检测效率。
31、(6)高效性：荧光定量pcr具有高效、迅速的特性，可以快速检测大量农药残留样品。
32、(7)成本降低：实时监测使得能够在pcr反应进行的同时获取数据，从而缩短了实验周期，可以降低农药残留检测成本。
33、(8)定性分析：利用荧光定量pcr可以通过荧光信号的强弱对线粒体基因表达进行定量分析，从而对残留农药进行定性分析，提供了更多信息。
34、(9)实用性强：所取浓度5μg/l≈5×10-3mg/kg(溶液浓度很低，密度可近似于水的密度ρ＝1kg/l)小于等于食品安全国家标准中各食品类别对啶虫脒的最大残留限量。
1.检测啶虫脒农药残留的分子标记组，其特征在于，所述分子标记组为nd1、nd4和nd5的组合；
2.扩增权利要求1所述的检测啶虫脒农药残留的分子标记组的引物，其特征在于，所述引物包括扩增所述nd1的引物对、扩增所述nd4的引物对和扩增所述nd5的引物对；
3.包含权利要求2所述引物的检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括总rna提取试剂、rna反转录试剂、内参基因扩增引物组、实时荧光定量pcr扩增试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，实时荧光定量pcr扩增试剂包括rox染料和荧光染料。
6.利用权利要求1所述的分子标记组或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒检测啶虫脒农药残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.权利要求1所述的分子标记组或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的检测试剂盒在检测啶虫脒农药残留中的应用，其特征在于，所述啶虫脒最低检出限为5μg/l。
8.权利要求1所述的分子标记组或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的检测试剂盒在鉴别农残污染类型中的应用，其特征在于，所述农残污染类型包括啶虫脒、毒死蜱和氟氯氰菊酯。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，待测农药分别胁迫培养叶角短肛以纯净水处理叶角短肛为对照组，培养结束后提取叶角短肛rna为模板，分别以seq idno.4-5、seq id no.6-7和seq id no.8-9序列为引物进行rt-qpcr反应，若nd1、nd4和nd5的表达量与对照组相比均显著上调则认为啶虫脒存在残留。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，nd1、nd4和nd5的表达量与对照组相比均显著上调表现为：
