本发明属于基因编辑领域，具体公开了一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法及其应用。
背景技术：
1、中国地鼠(chinese hamster)作为我国独有的特色鼠种，是生物医学领域中重要的实验动物之一。自中国地鼠引入实验室进行医学研究，逐步了解到其对某些细菌、病毒、原虫等具有高度敏感性，日益受到医学界重视。中国地鼠有一对易于翻出的颊囊，颊囊缺少腺体和完整的淋巴通路，属于天然免疫缺陷区。颊囊是进行组织培养、人类肿瘤移植和观察微循环改变的良好区域，利用仓鼠颊囊制备异种移植肿瘤模型，可表现出类似于人类原发肿瘤的组织学特征，这是小鼠做不到的。中国地鼠通过近亲交配而自发的遗传型糖尿病，更是研究糖尿病理想的实验动物模型。近年来，利用仓鼠制备肿瘤模型被广泛用于临床前研究，可以更好地模拟人类癌症的发生发展，再现人类癌症基因组异质性及其微环境的复杂性。国内外学者已利用中国地鼠特殊的生物特性建立了多种人类疾病动物模型，包括肿瘤、自发性ⅱ型糖尿病、脂类代谢和病毒、微生物、寄生虫感染等，尤其经dmba化学诱导制备了中国地鼠口腔黏膜癌模型，相较于小鼠口腔癌模型，此模型可以连续模拟人类口腔癌从癌前至恶性病变，为在体水平研究口腔癌提供了很好的平台。目前中国地鼠尚未建立转基因或基因敲除/敲入等动物模型，这限制了中国地鼠在生物医学研究中的进一步应用。因此，建立有效的中国地鼠基因组编辑平台至关重要。
2、针对中国地鼠基因编辑动物模型的建立遇到了以下的困难：
3、1.中国地鼠体型、体重与小鼠相似，但现有针对小鼠的超数排卵程序并不适用于中国地鼠。对于中国地鼠，5/7.5/10iu剂量的pmsg诱导的卵泡发育和黄体形成作用不明显。因此在使用此激素对中国地鼠进行超数排卵时，激素用量和注射时间的选择仍需探究。5/7.5/10iu剂量的hcg促进中国地鼠成熟卵母细胞从成熟卵泡排出的效果不佳，卵巢中未破裂卵泡数多，因此促进中国地鼠成熟卵泡破裂排卵的激素选择仍需探究。
4、2.体外胚胎培养是一种在实验室条件下模拟胚胎在母体内发育的过程。中国地鼠受精卵对可见光极端敏感，所受光照严重影响其正常发育，适宜的温度同样也是影响受精卵正常发育的关键因素。由于中国地鼠胚胎发育特有的生理学特性，大小鼠成熟的体外胚胎培养条件并不适用于中国地鼠。探究适用于中国地鼠的体外胚胎培养条件，需严格控制光照、温度等条件。
5、3.mirna在不同细胞以及组织器官中涉及众多靶分子和调控机制，但其调控机体细胞发育和组织器官功能的确切机制仍待大量研究阐明。mirna基因敲除动物模型为理解mirna功能和机制提供了重要的工具，现如今crispr/cas9技术的出现大大提高了mirna基因敲除动物模型的效率。但常规单sgrna靶向敲除目标mirna基因编辑效率低，需要改进sgrna设计方案以便高效获得mirna基因敲除动物模型。
6、4.中国地鼠在解剖学、生理学、免疫学和病理学方面与人类高度相似，在医学、遗传学和生物制药等研究领域都发挥着重要作用。随着研究的深入，逐渐揭示中国地鼠独特的生物学特性，至今已建立诸多的中国地鼠疾病动物模型。目前中国地鼠已广泛应用于分子生物学，也是医学研究领域中不可或缺的实验动物，但其应用程度远低于大、小鼠等常用实验动物。基于中国地鼠开发的基因编辑平台尚未建立，这为从基因水平利用中国地鼠研究疾病设置了障碍，严重限制了我国特色实验动物领域多元化发展。目前关于中国地鼠的基础研究不够深入和完善，开发不完全等，对特色动物资源形成了浪费，也不能完全满足科研工作者的需要，不利于整体实验动物行业，基础医学乃至临床治疗研究的发展等。研究人员应合理地开发利用中国地鼠这一宝贵的实验动物资源，使这一具有研究价值的实验动物资源得到保护、开发和广泛应用。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法及其应用。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明公开了四组双sgrna组合物，包括以下序列的sgrna：
4、sgrna1＝seq id no.1＝ctgacacagaatgacttcaa agg；
5、sgrna2＝seq id no.2＝atgctgctgttgggagaccc tgg；
6、sgrna3＝seq id no.3＝ggcagggtttcccatacagg agg；
7、sgrna4＝seq id no.4＝gtagcctgtgcctcctgtat ggg。
8、本方案中针对pre-mir-504序列设计sgrna，综合评分、脱靶得分与靶向位置设计四组双sgrna组合(g1+g3、g1+g4、g2+g3、g2+g4)。针对每组sgrna设计合成体外转录模板，使用hiscribe t7 quick high yield rna synthesis kit(neb e2050)进行体外转录，纯化回收sgrna，与cas9蛋白混合为rnp形式显微液，-80℃保存待用。
9、进一步的，本发明公开了上述双sgrna组合物在敲除中国地鼠mir-504基因中的用途。
10、进一步的，本发明还公开了一种基因敲除试剂，含有如权利要求1所述的双sgrna组合物。
11、进一步的，本发明还公开了一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，所述方法中包括使用上述双sgrna组合物。
12、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，包括以下步骤：
13、1)双sgrna组合物的设计与合成；
14、2)中国地鼠超数排卵与取卵；
15、3)受精卵显微注射；
16、4)胚胎移植；
17、5)f0代基因敲除中国地鼠鉴定。
18、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，
19、所述步骤2)包括以下具体步骤：
20、挑选6周龄雌性中国地鼠于day1 16:00腹腔注射15iu pmsg，day4 9:00腹腔注射15iu pmsg，16:00腹腔注射0.6μg lhrh进行超数排卵，激素注射后立即与雄鼠合笼。day57:00-9:00检栓，13:00取出输卵管，在含钙镁离子dpbs缓冲液中摘取膨大壶腹部的输卵管。自中国地鼠输卵管从母体脱离后，关闭环境照明，采用特殊红光体式显微镜进行后续操作。在0.1％透明质酸酶中撕开壶腹部，消化后放入洗胚液(含5％胎牛血清的含钙镁离子的dpbs缓冲液)中清洗直至成为单个受精卵，将受精卵进行分组，每15枚为一组放入m2培养液滴中后转入5％ co2、37℃培养箱中短暂培养20min，准备显微注射。
21、其中超排激素pmsg溶液配置浓度为0.1iu/μl，注射剂量为150μl/只；lhrh溶液配置浓度为0.004μg/μl，注射剂量为150μl/只。
22、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，所述步骤3)包括以下具体步骤：
23、注射前制备注射小室、显微操作针(注射针、持卵针)、玻璃长加样针，利用玻璃长加样针将sgrna与cas9蛋白混合显微注射液填充注射针针尖1cm；将持卵针和加有注射液的注射针分别插入充满石蜡油的持针器中，旋紧旋钮并安装到显微操作器上；在注射小室外矿物油内调整持卵针、注射针针尖，直至清晰；通过粗/细调加样旋钮结合磕针，调整注射针内注射液流速，直至注射针针尖显微注射液可稳定流出，控制注射液流速至每枚受精卵注射剂量为3-10pl；利用特殊红光显微注射系统，红光照射下挑选细胞饱满，透明带清晰，双原核清晰可见的受精卵进行注射，注射完后，剔除死亡的受精卵，挑选细胞饱满，透明带清晰的受精卵每15枚一组转移到m2液滴中准备移植。
24、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，所述步骤4)包括以下具体步骤：
25、从体重为25-35g，分娩过一胎且母性较好的代孕鼠群中经外阴观察及阴道涂片筛选发情期母鼠，与结扎雄鼠交配，挑选阴栓阳性母鼠移植待用。在受精卵显微注射时，同步将代孕雌鼠麻醉，在体式显微镜下，从背部平行于大腿根部靠上1cm处脊椎位置开口，向外拉出输卵管，止血夹夹住脂肪垫以固定输卵管。准备移植管，吸入1.5cm m2培养液，紧跟5个小气泡缓解虹吸作用，再吸入10～15枚受精卵，并将其控制在1cm液柱内，最后再吸入一个小气泡及少量培养液，总液面不能超过移植管的缩口部。避开血管撕开液体充盈的卵巢囊，显微镊夹住输卵管伞部，插入移植针，向其中吹入受精卵与气泡，输卵管内看见气泡即移植成功。随后将组织放回体腔，进行缝合，每只代孕母鼠单笼饲养。
26、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，所述步骤5)包括以下步骤：
27、剪f0代仔鼠鼠尾，提取基因组dna，pcr扩增鉴定基因型，经琼脂糖凝胶电泳，sanger测序，明确基因编辑f0代中国地鼠基因序列变化，鉴定为阳性鼠后，繁殖建系。
28、进一步的，上述一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，所述步骤5)中pcr扩增所使用的引物包括：
29、f:5′-ctgacctcaggccaatatgtag-3′＝seq id no.5
30、r:5′-gggtgtgtaggtaagagagaaag-3′＝seq id no.6。
31、进一步的，本发明还公开了上述方法或由其制备的中国地鼠模型在研制抗肿瘤药物中的用途。
32、本发明具有以下有益效果：
33、首先，本发明解决了以下1-5的难题：
34、1.中国地鼠超数排卵程序未成熟标准化，哺乳动物胚胎生物工程作为动物细胞工程研究的一个分支，发展十分迅速。此研究需要大量的卵子，来源之一就是应用超数排卵技术获得。常用的小鼠pmsg+hcg超数排卵方案，无论是从激素种类选择、注射剂量还是注射时间，并不适用于中国地鼠。本发明通过制定一套适用于中国地鼠独特的超数排卵程序，可以提高排卵数量和质量，高效率地获得所需数量的优质受精卵。不同啮齿动物模型的生理特征和激素反应可能存在差异，因此需要根据不同模型的特点进行技术调整和优化，本发明标准化了中国地鼠超数排卵方案，稳定性和可重复性好，提高了实验结果的可靠性和一致性。
35、2.中国地鼠胚胎体外培养条件尚未成熟，没有专门针对中国地鼠体外胚胎培养的培养基以及培养条件。小鼠成熟的体外胚胎培养条件并不适用于中国地鼠，因为中国地鼠的胚胎对可见光和温度波动极端敏感。本发明通过制定一套适用于中国地鼠独特的体外胚胎操作程序，可以使胚胎在离体条件下存活且保持高活力，为研究中国地鼠的胚胎工程和生殖生物学领域奠定了基础。
36、3.本发明解决了目前mirna基因敲除中国地鼠模型效率低的问题。根据mirna的成熟机制，设计双sgrna靶向敲除mirna前体序列及种子序列，并使用sgrna+cas 9蛋白复合物(rnp)形式注射液，可高效提高基因编辑效率。
37、4.本发明丰富了目前mir-504基因编辑动物模型，mir-504在肿瘤的发生发展中作用非常复杂，既可作为致癌因子，也可作为抑癌因子发挥作用。本发明提供了构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法和应用，能够补充当前小鼠模型，具有模拟与mir-504相关的多种人类疾病的潜力，可深入研究疾病的发病机制，为药物研发和临床试验提供了重要依据，本发明为研究mir-504在不同疾病中的作用机制提供了有效动物模型，进一步推广了中国地鼠在生物医学研究中的应用。
38、5.中国地鼠是我国具有研究价值的特色实验动物资源，在医学、遗传学和生物制药等研究领域都发挥着重要作用，现有多种基于中国地鼠制备的疾病动物模型，广泛应用于糖尿病、脂类代谢以及肿瘤研究。但目前仍未开发出高效可行的中国地鼠动物模型基因编辑平台，极大地影响了中国地鼠特色实验动物资源开展更深层面的研究以及推广与应用。本发明提供了有效的中国地鼠动物模型基因编辑平台，填补了目前基因编辑中国地鼠动物模型的空白，完善了中国地鼠特有的超数排卵与取卵、体外胚胎培养、工具鼠制备、显微注射、胚胎移植等程序。本发明制备的新型基因编辑中国地鼠动物模型具有可靠性和可重复性，同时模型能够通过诱导方法制备特定的疾病或表型，可模拟人类疾病。探索多种啮齿类动物模型和人类之间癌症易感性和治疗反应的物种差异背后的遗传、生化和其他因素，可以显著补充和提高啮齿动物模型在癌症研究中的实用性。本发明将crispr/cas9技术应用于中国地鼠动物模型实现基因编辑，从而实现对其表型和性状的改造，广泛应用于制备人类疾病中国地鼠模型、疾病研究、药物筛选等领域。同时拓宽啮齿类基因工程动物模型领域，可以与现有模型相互补充并提高它们作为人类癌症模型的整体价值。
39、其次，从实施例可以看出，本发明提供了适用于中国地鼠独特的大剂量pmsg分次注射+lhrh超数排卵方案，可稳定高效获得中国地鼠受精卵；提供了红光胚胎操作系统以及37.5℃且避冷光的环境以适用于中国地鼠受精卵体外培养，可提高中国地鼠受精卵活性及存活率；提供了针对于中国地鼠mir-504基因靶向敲除的双sgrna组合，提高了基因编辑效率；提供了适用于雄性中国地鼠结扎手术方案以及筛选中国地鼠代孕母鼠方案，提高了代孕母鼠的见栓率，为后续胚胎移植奠定了基础；提供了包括有角度的15°显微操作针、显微注射液加样方案、特有的红光显微注射操作系统以及选择双原核期比例高的受精卵特定时间段注射方案，提高了受精卵显微注射后存活率；提供了m2-气泡-10～15枚受精卵-气泡的胚胎移植方案，减少移植受精卵数以顺应中国地鼠正常受孕产仔数少的生殖特性，提高了受精卵移植后正常着床的可能性。综上，本发明提供了适用于中国地鼠这一特有实验动物资源的基因编辑动物模型平台，可高效制备基因编辑中国地鼠动物模型，为从基因层面研究人类疾病的发病机理以及疾病进展机制提供了新的思路和平台。
1.一组双sgrna组合物，其特征在于，包括以下序列的sgrna：
2.如权利要求1所述的双sgrna组合物在敲除中国地鼠mir-504基因中的用途。
3.一种crispr/cas9基因敲除试剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的双sgrna组合物。
4.一种基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法,其特征在于，所述方法中包括使用如权利要求1所述的双sgrna组合物。
5.根据权利要求4所述的基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，其特征在于，
7.根据权利要求5所述的基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，其特征在于，
8.根据权利要求5所述的基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，其特征在于，
9.根据权利要求5所述的基于crispr/cas9构建mir-504基因敲除中国地鼠模型的方法，其特征在于，
10.如权利要求4-9任一项所述的方法或由其制备的中国地鼠基因编辑动物模型在研制抗肿瘤药物中的用途。
