本发明涉及工业生产的，具体为一种通过添加中药醇提物促进蛹虫草生产生物活性胞外多糖的方法。
背景技术：
1、药食用真菌蛹虫草(cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，和冬虫夏草同为虫草属的模式种，已实现人工规模化培育。作为中国最重要的传统中药之一，蛹虫草因其活性成分种类丰富多样得到广泛应用。虫草多糖是蛹虫草研究中最热门的活性成分之一，主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖等组成。根据来源，可将蛹虫草多糖分为子实体多糖、菌丝体胞内多糖和胞外多糖(eps)三大类。其中，eps是液体培养过程中菌丝体分泌到胞外的代谢产物，不仅与天然虫草多糖的组成和结构相似，还具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血脂、降尿酸等优良的生理活性，而且液体发酵获得eps具有生产周期短、提取加工方便、成本较低等特点。现阶段国内外研究多集中在蛹虫草多糖的提取纯化工艺、结构分析、理化性质和功能活性研究等方面，而在野生资源锐减的同时，围绕蛹虫草开发的加工食品、保健产品及医药产品对蛹虫草原料需求日益增大，使进一步提高人工培育蛹虫草质量、增加其关键活性产物的产量成为重要的研究方向。
2、快速、高效、经济地获得药用真菌eps的方法是采用液体发酵培养。研究表明培养基组成对eps产量的影响至关重要。为了能最大量获得eps，在药用真菌液体发酵体系中添加一定的外源刺激物，能同时促进菌体细胞的生长和次生代谢产物的生物合成。诸多研究表明，采用外源中药作为添加物对提高发酵菌株活性代谢产物的生物合成可产生正向调控作用。在培养基中添加适量中药成分，可显著促进真菌生长或提高活性代谢产物的产量。原因或是诱导代谢途径中特定酶的基因表达，或是调节关键酶活性，或是改变细胞通透性，从而最大限度地在发酵液中积累目的产物，有效调控代谢物的生产。
3、现有技术方案：
4、zhang等在发酵培养基中加入适量的薏苡仁粉末作为诱导剂，可以促进蛹虫草eps的生产，却对eps的结构和抗氧化活性影响不大。(chao zhang,lei jiang,zi wang.effectof coix seed on exopolysaccharide production of cordyceps militaris in liquidculture[j].arabian journal of chemistry,2021,14:102999.)。
5、侯若琳等向蛹虫草发酵培养基中添加适量的扁桃斑鸠菊叶粉末，在最优条件下eps产量与空白组相比提高205％，且对eps结构和抗氧化活性影响较小。(侯若琳,李琳,项凯凯,等.利用扁桃斑鸠菊叶发酵生产蛹虫草胞外多糖的条件及其抗氧化活性[j].生物工程学报,2019,35(4):667-676.)。
6、胡永乐等以厚朴为药性基质，对蛹虫草进行双向液体发酵，在发酵培养基中添加5g厚朴使发酵产物中eps含量为3.11g/l。(胡永乐,张传海,林崇展,等.响应面法优化蛹虫草与厚朴双向液体发酵工艺[j].菌物学报,2020,39(5):944-954.)。
7、上述技术的主要缺点有：1.直接添加中药或其水提物，发酵得到的真菌多糖中可能混合有中药多糖；2.直接添加过多中药粉末会影响发酵的传质效果，或者粉末会在摇瓶发酵时对菌丝体产生剪切作用；3.直接添加中药发酵得到的eps，产量虽有提高，但其生物活性的增强效果不明显。
8、导致上述缺点存在的主要原因包括：1.中药本身或其水提物中多糖能溶于水，若在发酵结束时有中药多糖残留，会对发酵得到的真菌多糖的测定产生影响；2.一定量的中药中能促进eps生产的有效物质有限，添加大量的中药粉末才能达到提高eps产量的效果，过多中药粉末则会影响营养物质、氧气等的传质效果，甚至是对菌丝体产生剪切作用的损伤；3.直接添加中药发酵得到的eps，结构变化较小，引起生物活性的变化也较小。
9、因此，如何能够快速高效地获得蛹虫草eps成为本领域一直以来的研究重点。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，为了高效地获得蛹虫草eps，本发明在发酵培养基中添加适量中药醇提物作为刺激/诱导剂，排除中药本身或其水提物中多糖对蛹虫草发酵得到的eps的影响，旨在调控次级代谢途径，促进eps的合成和分泌，提高eps产量和增强eps抑菌活性。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
3、一种中药醇提物的应用，用于促进蛹虫草生产胞外多糖。
4、其中，中药醇提物是通过使用醇类有机溶剂对中药进行提取、分离、纯化等步骤得到的具有明确化学成分的一种或一类物质，这种或这类提取物通常具有较高的纯度和明确的化学组成，使得其在剂量、疗效等方面具有更可观的操作性。相比之下，传统中药的成分较为复杂，所需剂量大，疗效也往往难以精确控制。而且多糖是溶于水、不溶于醇的，使用醇类提取中药的有效物质进行蛹虫草生产胞外多糖的探究，极大地避免中药多糖对蛹虫草真菌多糖研究的影响。研究意外发现，中药中，溶于醇的有效成分，可以有效促进蛹虫草生产胞外多糖，并提高所获得的胞外多糖的品质，提高抑菌活性。
5、优选的，所述中药醇提物包括薏苡仁醇提物、厚朴醇提物、红枸杞醇提物、黑枸杞醇提物、刺五加醇提物、车前草醇提物中的一种或多种。
6、优选的，所述中药醇提物包括红枸杞醇提物。
7、本发明在蛹虫草液体发酵中添加红枸杞醇提物发酵后的eps-l比空白组eps-c对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有更强的抑菌效果，表明添加红枸杞醇提物对发酵后的eps抑菌活性有明显的增强作用。
8、优选的，所述中药醇提物的浓度包括0.5～10g/l。
9、优选的，所述中药醇提物的浓度包括2g/l。
10、本发明在发酵培养基中添加适量中药醇提物作为刺激/诱导剂，排除中药本身或其水提物中多糖对蛹虫草发酵得到的eps中可能混合有中药多糖的影响，调控次级代谢途径，促进eps的合成和分泌，提高eps产量。其中，在发酵刚开始时添加2g/l红枸杞醇提物对蛹虫草进行5天液体发酵的eps促产效果是最为显著的。
11、优选的，所述中药醇提物的制备包括如下步骤：
12、s1、将中药洗净、干燥、粉碎，获得中药粉末；
13、s2、将所述中药粉末浸泡在有机溶剂中进行提取，之后固液分离，获得第一分离液和分离渣；
14、s3、将所述分离渣浸泡在有机溶剂中进行提取，之后固液分离，获得第二分离液；
15、s4、合并所述第一分离液和所述第二分离液，除去所述有机溶剂，用水复溶，获得所述中药醇提物。
16、优选的，所述有机溶剂包括无水乙醇；步骤s1中，所述中药洗净后，在45℃下干燥；步骤s2中，所述中药粉末与有机溶剂按照质量体积比1g:10ml进行浸泡，提取时间包括24h；固液分离方式包括过滤；步骤s3中，有机溶剂的用量与步骤s2相同；固液分离方式包括过滤；步骤s4中，通过旋转蒸发除去所述有机溶剂。
17、优选的，包括如下步骤：
18、a、活化菌种：将蛹虫草菌种接种于活化平板的活化培养基中，进行活化培养，每次传代后低温保存；
19、b、制备种子液：将所述活化平板上的蛹虫草菌种置于无菌水中，打散后稀释镜检，得到孢子悬浮液；将孢子悬浮液与种子培养基混合，进行种子化培养，得到种子液；
20、c、制备发酵体系：将所述中药醇提物除菌，之后添加到发酵培养基中，获得发酵体系；
21、d、发酵：将所述种子液与所述发酵体系混合，进行发酵培养，获得发酵滤液。
22、优选的，步骤a中，所述蛹虫草菌种使用前储存于-80℃的环境中；所述活化平板包括pda平板；所述活化培养基包括土豆、葡萄糖、琼脂；所述活化培养的条件包括：将所述蛹虫草菌种接种后25℃避光静置培养7天，记为第一代菌种；将所述第一代菌种重新接种后25℃避光静置培养7天，记为第二代菌种；将所述第二代菌种重新接种后25℃避光静置培养14天，记为第三代菌种，用于后续所述种子液的制备；步骤b中，所述活化平板上的蛹虫草菌种用玻璃珠打散后；所述孢子悬浮液的孢子数包括1×106个/ml；所述孢子悬浮液与所述种子培养基的体积比包括1:9；所述种子培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、kh2po4、mgso4·7h2o；所述种子化培养的条件包括25℃、摇瓶140rpm振荡培养2天；步骤c中，所述除菌包括使用0.22μm滤膜过滤除菌；所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、kh2po4、mgso4·7h2o；步骤d中，所述发酵培养的条件包括25℃、摇瓶140rpm振荡培养5天。
23、优选的，所述活化培养基包括200g/l土豆，20g/l葡萄糖，20g/l琼脂；所述种子培养基包括20g/l葡萄糖，1g/l酵母浸粉，2g/l kh2po4，1g/lmgso4·7h2o；所述发酵培养基包括40g/l葡萄糖，2g/l酵母浸粉，2g/l kh2po4，1g/l mgso4·7h2o；所述活化培养基、所述种子培养基、所述发酵培养基使用前均以121℃灭菌20min。
24、与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
25、1.本发明在发酵培养基中添加适量中药醇提物作为刺激/诱导剂，排除中药本身或其水提物中多糖对发酵得到的真菌多糖中可能混合有中药多糖的影响，旨在调控次级代谢途径，促进eps的合成和分泌，提高eps产量，高效地获得蛹虫草eps。
26、2.本发明优化了蛹虫草液体发酵中中药(最优为红枸杞)醇提物的添加条件，在发酵刚开始时添加2g/l红枸杞醇提物对蛹虫草进行5天液体发酵的eps促产效果是最为显著的。
27、3.本发明在蛹虫草液体发酵中添加红枸杞醇提物发酵后的eps-l比空白组eps-c对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有更强的抑菌效果。
1.一种中药醇提物的应用，其特征在于，用于促进蛹虫草生产胞外多糖。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药醇提物包括薏苡仁醇提物、厚朴醇提物、红枸杞醇提物、黑枸杞醇提物、刺五加醇提物、车前草醇提物中的一种或多种。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药醇提物包括红枸杞醇提物。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药醇提物的浓度包括0.5～10g/l。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药醇提物的浓度包括2g/l。
6.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药醇提物的制备包括如下步骤：
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述有机溶剂包括无水乙醇；步骤s1中，所述中药洗净后，在45℃下干燥；步骤s2中，所述中药粉末与有机溶剂按照质量体积比1g:10ml进行浸泡，提取时间包括24h；固液分离方式包括过滤；步骤s3中，有机溶剂的用量与步骤s2相同；固液分离方式包括过滤；步骤s4中，通过旋转蒸发除去所述有机溶剂。
8.如权利要求1所述应用，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，步骤a中，所述蛹虫草菌种使用前储存于-80℃的环境中；所述活化平板包括pda平板；所述活化培养基包括土豆、葡萄糖、琼脂；所述活化培养的条件包括：将所述蛹虫草菌种接种后25℃避光静置培养7天，记为第一代菌种；将所述第一代菌种重新接种后25℃避光静置培养7天，记为第二代菌种；将所述第二代菌种重新接种后25℃避光静置培养14天，记为第三代菌种，用于后续所述种子液的制备；每次传代后置于4℃保存；步骤b中，所述活化平板上的蛹虫草菌种用玻璃珠打散后；所述孢子悬浮液的孢子数包括1×106个/ml；所述孢子悬浮液与所述种子培养基的体积比包括1:9；所述种子培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、kh2po4、mgso4·7h2o；所述种子培养的条件包括25℃、摇瓶140rpm振荡培养2天；步骤c中，所述除菌包括使用0.22μm滤膜过滤除菌；所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、kh2po4、mgso4·7h2o；步骤d中，所述发酵培养的条件包括25℃、摇瓶140rpm振荡培养5天。
10.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述活化培养基包括200g/l土豆，20g/l葡萄糖，20g/l琼脂；所述种子培养基包括20g/l葡萄糖，1g/l酵母浸粉，2g/l kh2po4，1g/lmgso4·7h2o；所述发酵培养基包括40g/l葡萄糖，2g/l酵母浸粉，2g/l kh2po4，1g/l mgso4·7h2o；所述活化培养基、所述种子培养基、所述发酵培养基使用前均以121℃灭菌20min。
