本发明涉及病毒核酸检测方法，尤其涉及一种covid-19核酸检测引物组，以及一种covid-19等温扩增核酸检测试剂盒。
背景技术：
1、2019新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，2020年2月11日被who世界卫生组织命名为covid-19。
2、实时荧光rt-pcr检测covid-19病毒核酸已成为诊断covid-19的标准诊断方法，但存在局限性，假阴率较高。因此一种具有免核酸提取，缩短检测时长，防止二次污染等优点的准确、可视化快速鉴定出大量感染者和无症状携带者的试剂盒，实现covid-19大量感染者和无症状携带者的快速筛查，对防止病毒传播，保证患者得到及时治疗具有重大意义。
技术实现思路
1、为提高covid-19病毒的准确、快速筛查，本发明的第一目的是提供covid-19病毒的n基因核酸检测引物组，实现对covid-19的检测。
2、本发明的第二目的在于提供一种covid-19的检测试剂盒，对鼻咽拭子样本免核酸提取，利用n基因核酸检测引物组，实现可视化covid-19快速检测。
3、实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
4、本发明提供的四种covid-19病毒的检测引物组，根据目前发布的新型冠状病毒的序列，(genbank:mn908947.3)全长为29903bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列设计环介导等温扩增引物，应用primer explorer软件设计covid-19病毒n端特异性引物组，利用逆转录等温扩增技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现快速检测，对仪器要求低，可通过肉眼观察检测结果，适合现场、基层的快速检测covid-19病毒，方便筛查covid-19病毒感染者。
5、第一方面，本发明提供一种covid-19核酸检测引物组，包括一对外引物f3-1和b3-1、一对内引物fip-1和bip-1、以及一对环引物lf-1、lb-1；
6、所述f3-1、b3-1、fip-1、bip-1、lf-1、lb-1的核苷酸序列seq id no如下：
7、f3-1：tggaccccaaaatcagcg；
8、b3-1：ggaacgccttgtcctcga；
9、fip-1：ccactgcgttctccattctggt-aaatgcaccccgcattacg；
10、bip-1：gcgatcaaaacaacgtcggcc-tccttgccatgttgagtgag；
11、lf-1：ccagttgaatctgagggtccac；
12、lb-1：tgcgtcttggttcaccgc。
13、第二方面，本发明提供一种covid-19核酸检测引物组，包括一对外引物f3-2和b3-2、一对内引物fip-2和bip-2、以及一对环引物lf-2、lb-2；所述f3-2、b3-2、fip-2、bip-2、lf-2、lb-2的核苷酸序列seq id no如下：
14、f3-2：tggaccccaaaatcagcg；
15、b3-2：gccttgtcctcgagggaat；
16、fip-2：ccactgcgttctccattctggt-aatgcaccccgcattacg；
17、bip-2：caacgtcggccccaaggttt-ggtcttccttgccatgttga；
18、lf-2：actgccagttgaatctgaggg；
19、lb-2：gcgtcttggttcaccgct。
20、第三方面，本发明提供一种covid-19核酸检测引物组，包括一对外引物f3-3和
21、b3-3、一对内引物fip-3和bip-3、以及一对环引物lf-3、lb-3；
22、所述f3-3、b3-3、fip-3、bip-3、lf-3、lb-3的核苷酸序列seq id no如下：
23、f3-3：cacccgcaatcctgctaac；
24、b3-3：ccagccattctagcaggaga；
25、fip-3：tgctcccttctgcgtagaagc-gctgcaatcgtgctacaact；
26、bip-3：ggcggcagtcaagcctcttc-cctactgctgcctggagtt；
27、lf-3：tggcaatgttgttccttgagg；
28、lb-3：atcacgtagtcgcaacagttc。
29、第四方面，本发明提供一种covid-19核酸检测引物组，包括一对外引物f3-4和b3-4、一对内引物fip-4和bip-4、以及一对环引物lf-4、lb-4；
30、所述f3-4、b3-4、fip-4、bip-4、lf-4、lb-4的核苷酸序列seq id no如下：
31、f3-4：agatcacattggcacccg；
32、b3-4：ccattgccagccattctagc；
33、fip-4：tgctcccttctgcgtagaagc-caatgctgcaatcgtgctac；
34、bip-4：gcggcagtcaagcctcttctc-cctactgctgcctggagt；
35、lf-4：ttggcaatgttgttccttgagg；
36、lb-4：cacgtagtcgcaacagttcaa。
37、第五方面，本发明提供一种covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液a、反应预混液b、检测管、阳性质控、阴性对照，主要包括以下物质：1)bst dna大片段聚合酶；2)amv逆转录酶；3)10x反应缓冲液；4)第一至第四任一方面所述的covid-19的核酸检测引物组；5)dntps；6)硫酸镁；7)甜菜碱；8)甲酰胺；9)depc水。
38、其进一步地技术方案为，所述反应预混液a包括bst dna大片段聚合酶2-10u、amv逆转录酶2-10u；
39、所述反应预混液b包括10x反应缓冲液、第一至第四任一方面所述的covid-19的核酸检测引物组、dntps 1-5mm、硫酸镁1-12mm、甜菜碱0.2-1.2mm、甲酰胺和depc水。
40、其进一步地技术方案为，所述甲酰胺选用体积分数50％以下的甲酰胺溶液。
41、优选地，所述甲酰胺选用体积分数2-30％的甲酰胺溶液。
42、其进一步地技术方案为，所述阳性质控为covid-19基因组片段；所述阴性对照为depc水。
43、其进一步地技术方案为，反应预混液b中所述的covid-19的核酸检测引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
44、以上所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和显色结果判定：
45、(1)待检咽拭子样品或核酸片段，可对咽拭子样本的病毒直接测试，无需核酸提取。
46、(2)反应体系及条件：检测管中的反应体系含有3ul反应预混液a，17ul反应预混液b；同时设置阳性质控和阴性对照，将检测管内的溶液混匀后离心，于50-70℃反应30-60min，并在85℃中断反应。
47、(3)可视化检测结果判断：
48、根据检测管内反应体系的颜色判断检测结果，将扩增产物反应管置于比色卡中，检测结果呈蓝色则检测结果判定为阳性，即检测样本中含有covid-19；检测结果呈紫色则检测结果判定为阴性，即检测样本中不含covid-19。
49、本发明提供的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒应用于检测鼻咽拭子样品检测结果的示意图如图1所示，p为阳性质控，covid-19基因组片段；n为阴性对照，depc水；1、4为阴性样本；2、3为阳性样本，含有covid-19的鼻咽拭子样本(已确诊)。在白纸背景下观察反应液颜色，p阳性质控和2、3阳性样本呈蓝色，蓝色则说明样本中含有covid-19，1、4阴性样本和n阴性对照呈紫色，紫色则说明样本中没有含covid-19。
50、本发明的有益效果是：
51、1)本发明根据genebank中公布的covid-19的n端基因序列，设计特异性等温扩增引物组，用于特异性检测covid-19。通过构建covid-19含有n端基因的假病毒作为阳性质控，建立了准确、快速的covid-19检测方法。实验表明，本发明试剂盒，可特异性检测covid-19，与eb病毒，hcmv病毒，呼吸道常见病毒(如甲/乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒和人副流感病毒等)和肠道病毒等不发生交叉反应；
52、2)本发明提供的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，针对咽拭子样本可无需核酸提取，在65℃等温条件下，1小时内可准确、闭管式可视化快速检测筛查covid-19病毒感染。
53、3)本发明提供的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒检测结果判定简单，肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断。
54、综上，本发明提供的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒封闭操作，保证了操作人员及环境的安全。可用于医院、诊所和检测实验室对covid-19携带者进行快速筛查。
1.一种covid-19核酸检测引物组，其特征在于，包括一对外引物f3-3和b3-3、一对内引物fip-3和bip-3、以及一对环引物lf-3、lb-3；
2.一种covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，包括反应预混液a、反应预混液b、检测管、阳性质控、阴性对照，其特征在于，主要包括以下物质：1)bst dna大片段聚合酶；2)amv逆转录酶；3)10x反应缓冲液；4)权利要求1任一项所述的covid-19的核酸检测引物组；5)dntps；6)硫酸镁；7)甜菜碱；8)甲酰胺；9)depc水。
3.根据权利要求2所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应预混液a包括bst dna大片段聚合酶2-10u、amv逆转录酶2-10u；
4.根据权利要求3所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用体积分数50％以下的甲酰胺溶液。
5.根据权利要求4所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，所述甲酰胺选用体积分数2-30％的甲酰胺溶液。
6.根据权利要求2所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控为covid-19基因组片段；所述阴性对照为depc水。
7.根据权利要求2所述的covid-19等温扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，反应预混液b中所述的covid-19的核酸检测引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
