本发明涉及对αβt细胞受体(αβtcr)具有特异性之抗体。特定而言，本发明涉及源自鼠类单克隆抗体bma031的人源化抗αβtcr抗体及该人源化抗体在免疫抑制疗法中之用途。
背景技术：
1、介绍
2、有大量文件证明免疫抑制剂在自身免疫疾病及器官移植疗法中之用途；然而该方法远非最佳。毒性、伺机性感染、细胞因子风暴(cytokine storm)及癌症风险增加在用这些药剂治疗之患者中普遍存在。在此情形下使用生物制剂已一定程度地改良患者结果，但这些副效应仍明显。
3、就免疫抑制而言，使用针对淋巴细胞之多克隆抗血清是熟知的。然而，抗血清之产生极为费力，其显示在不同批次间有所变化之性质，且可使用多克隆抗血清获得之特异性是有限的。
4、藉由杂交瘤技术产生单克隆抗体首先由及milstein(nature256:495-497(1975))描述。与多克隆抗血清相比，单克隆抗体(mab)之特异性更高，且具有更一致性质。mab已最频繁且成功地在临床器官移植中用于免疫抑制疗法。然而，用作治疗自身免疫疾病之免疫抑制剂及用于移植患者之大多数mab具有宽免疫抑制能力，因此不合意地影响众多免疫细胞之功能，推测这些免疫细胞并非全部参与移植物排斥。
5、针对t细胞表面受体抗原之小鼠单克隆抗体首先于1979年使用杂交瘤技术产生(kung等(1979)science 206:347-349)。在由kung等发现之三种单克隆抗体中，一种抗体命名为莫罗单抗(muromonab)-cd3(okt3)，其对t细胞之cd3受体具有经界定之特异性，与95％以上外周成熟t细胞反应而不影响未成熟胸腺细胞。okt3与cd3复合物之结合引起cd3受体之内在化及从外周损失cd3阳性细胞。成功的okt3治疗与cd3阳性t细胞自约60％迅速下降至小于5％相关。
6、okt3已广泛地用于治疗在肾移植后经受急性同种异体移植物排斥之患者(russell,p.s.、colvin,r.b.、cosimi,a.b.(1984)annu.rev.med.35:63及cosimi,a.b.、burton,r.c.、colvin,r.b.等(1981)transplantation 32:535)。而且，使用okt3及兔补体自供体骨髓清除成熟t细胞以在同种异体骨髓移植中预防急性移植物抗宿主疾病(gvhd)(prentice,h.g.,blacklock,h.a.,janossy,g.等(1982)lancet 1:700及blacklock,h.a.、prentice,h.g.、gilmore,m.j.等(1983)exp.hematol.11:37)。尽管okt3治疗似乎在用于急性白血病之同种异体骨髓移植中预防gvhd是有效的，但在对严重组合免疫缺陷的治疗过程中，用okt3进行组合体外/体内治疗无法预防gvhd(hayward,a.r.等(1982)clin.lab.observ.100:665)。用okt3处理t细胞诱发若干与免疫抑制不一致之反应，包括t细胞活化、免疫介质之产生及t3调节。假定由cd3-mab(例如，okt3)识别之t3抗原复合物在t细胞活化期间起关键作用。α/βt淋巴细胞藉助统称为αβt细胞抗原受体(tcr)·cd3复合物之多聚蛋白总体识别肽-mhc配体。此结构由结合抗原之可变αβtcr二聚物及3个不变二聚物(cd3γε、δε及ζζ)构成，这些不变二聚物参与tcr·cd3表面输送、稳定及信号转导。αβt细胞受体(αβtcr)系在大多数(约95％)的t细胞上表达且经由展示于mhc上之抗原的接合在t细胞活化中具有关键作用。其余5％细胞是γδt细胞受体(γδtcr)阳性。γδtcr阳性细胞群体在针对细菌、病毒及真菌来源之伺机性感染进行防御之先天免疫反应中起重要作用。γδt细胞在移植中之移植物排斥中不起作用。因此，靶向αβtcr阳性细胞群体及节约γδtcr阳性群体应允许显著治疗效果，同时维持针对伺机性感染之基线免疫保护。
7、小鼠igg2b单克隆抗体bma031(borst等(1990年11月)hum.immunol.29(3):175-88；ep0403156)对tcrα/β/cd3复合物上之共同决定簇具有特异性，且不结合γ-δtcr。bma031具有高度免疫抑制性且能经由活化诱导性细胞死亡(aicd)机制诱导经活化t细胞之细胞凋亡(wesselborg等(1993年5月)j.immunol.150(10):4338-4345)。其在体外抑制混合淋巴细胞反应且其已在诸多实体器官移植情形中之移植物排斥之预防中以及急性移植物抗宿主疾病(agvhd)之治疗中显示初步临床效果(kurrle等(1989年2月)transplant proc.21(1):1017-1019)。bma031不接合大多数人类群体中之人类fcγ受体(fcγr)(约10％的人具有结合小鼠igg2b同种型之fcγr)。由此，该抗体不会经由t细胞受体交联引起t细胞活化且因此，其不诱导t细胞活化或相关细胞因子释放。就此而言，其概貌(profile)相对于okt3之概貌是高度优选的。然而，bma031系鼠类抗体，且由此鉴于其在人类受试者中所引发之人类抗小鼠抗体(hama)反应而不适于重复在人类受试者中剂量给药。
8、已描述bma031之若干人源化形式(参见，ep 0403156；亦参见shearman等，(1991)j.immunol.147:4366-4373)。如ep0403156中所述，仅有cdr移植并不能成功地保持抗原结合。一种具有显著框架修饰之克隆euciv3成功地结合t细胞；然而，如ep0403156中所述，与αβtcr之结合不如亲代bma031抗体有效，如藉由流式细胞术竞争测定法所确定的。我们还显示，euciv3抑制体外免疫反应之能力与bma031相比显著降低(参见图2)。此外，euciv3最初在仍保持fcγr结合之野生型人类igg1或igg4骨架上产生。因此，这些人源化抗体允许t细胞活化、增殖及伴随之细胞因子释放且由此显著不同于bma031之原有性质。
9、抗体糖基化的修饰是本领域已知的。例如，已知非糖基化抗体可具有经广泛修饰之功能；参见boyd等(1996)mol.immunol.32:1311-1318。然而，先前尚未描述人源化bma031之非糖基化形式或具有经修饰糖基化模式之衍生物。
10、因此，本领域需要抗αβtcr人源化抗体，其改良euciv3之结合性质且有利地保持bma031之免疫抑制性及非t细胞活化性质。
技术实现思路
1、在第一方面中，提供人源化单克隆抗体，其包含bma031之cdr且保持bma031对其同源抗原之结合亲和力。在第一实施方案中，该人源化抗体包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:7、12或13中所述之cdr及seq id no:17中所述之人类igh3-23框架，其中框架位置6是供体残基；在替代实施方案中，框架位置18是供体残基。视情况，框架位置49和/或69是供体残基。
2、在第二实施方案中，人源化单克隆抗体包含重链可变区，该重链可变区包含seqid no:15或16中所述之cdr及seq id no:18中所述之人类ighv1-3*01框架，其中框架位置38、44和/或48中之一或多者是供体残基；在替代实施方案中，框架位置44及48是供体残基。
3、在第三实施方案中，人源化单克隆抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含seqid no:14中所述之cdr及seq id no:19中所述之人类igkv3-11*01框架，其中框架位置70和/或71是供体残基。视情况，位置46是供体残基。
4、根据第一实施方案之抗体之实例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体，所述重链可变区选自包含seq id no:7、seq id no:12及seq id no:13中所述之序列的重链，所述轻链可变区序列包含seq id no:14中所述之序列。
5、第二实施方案之抗体之实施例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体，所述重链可变区选自包含seq id no:15及seq id no:16中所述之序列之重链，所述轻链可变区序列包含seq id no:14中所述之序列。根据所述实施方案之人源化抗体是bma031之人源化形式。其一级结构与人源化抗体euciv3之一级结构不同，euciv3与bma031相比与αβtcr之结合有所减少。
6、在序列表中，藉助注释或加下划线来指示cdr。框架系在cdr以外之所有序列，其系根据“kabat”编号系统定义且在适用时藉由使用“imgt”cdr定义来扩展。若不指示改变框架残基来匹配供体序列，则通常应将该残基理解为受体残基。
7、人源化抗体可包含恒定区。在一个实施方案中，恒定区是人类来源的。
8、本发明的人源化抗体可进一步藉由fc工程改造来修饰。免疫球蛋白易于使fcγ受体交联，此可导致抗t细胞抗体之组成型t细胞活化。为避免fcγ交联，可(例如藉由产生fab或fv片段来)修饰抗体以去除fc区；然而，经截短的免疫球蛋白缺乏有益效应子功能且展现较短血清半衰期。因此，人源化抗体之fc区可经修饰以防止fcγ交联。例示性技术包括(例如通过由n297q突变修饰fc区来)产生非糖基化免疫球蛋白。无法结合fcγ之免疫球蛋白亦由armour等(1999)eur.j.immunol.29:2613-2624描述。实现igg1之修饰称为δab修饰，且由δa突变(其中igg残基系于位置327、330及331处取代，且igg2残基系于位置233-236处取代)与δb突变(其中缺失残基236)之组合组成。在另一实施方案中，根据本发明的抗体之糖基化模式可经修饰。
9、在一个实施方案中，抗体包含突变s298n、t299a及y300s中之一或多者。
10、在实施方案中，抗体包含突变n297q、s298n、t299a及y300s中之两者或更多者。例如，提供包含多重突变n297q/s298n/y300s、s298n/t299a/y300s或s298n/y300s之人源化抗体。
11、在第二方面中，提供包含bma031之cdr且保持bma031之t细胞抑制性质之人源化单克隆抗体。该人源化抗体优选包含具有seq id no:12、13、15或16中所述之氨基酸序列之重链可变区及包含seq id no:14中所述之氨基酸序列之轻链可变区。
12、在第三方面中，提供至少编码根据所述实施方案的前述方面的人源化单克隆抗体的重链可变区的核酸。该核酸可编码人源化抗体的可变区及恒定区。可在不同核酸上或在相同核酸分子上编码重链及轻链。
13、根据第四方面，提供表达根据前述方面之核酸之细胞。细胞是(例如)培养中适于表达抗体分子之细胞。核酸可包括信号序列和/或其它序列或修饰，这些其它序列或修饰系抗体分子在细胞中之表达和/或抗体分子自细胞之分泌所必需，或对其进行调节。
14、在又一实施方案中，如上述方面中所述提供人源化抗体，其用于抑制受试者中之t细胞介导的反应。
15、例如，t细胞介导的反应可参与选自以下之状况：组织移植(tissuetransplantation)(包括实体器官移植及复合性组织移植)、组织移植(tissue grafting)、多发性硬化及1型糖尿病。
16、此外，另一实施方案提供用于治疗罹患涉及异常t细胞介导的反应之病况之受试者的方法，其包括向有需要之受试者施用治疗有效剂量之根据所述实施方案之抗体。
17、因此，已产生不诱导细胞因子释放之人源化非活化抗αβtcr抗体，其能选择性调节αβtcr并诱导经活化αβtcr阳性t细胞之细胞凋亡。已经产生这些抗体以供在t细胞介导疾病中用作免疫抑制剂。已通过小鼠抗αβtcr抗体bma031之人源化及藉由对人源化抗体之fc工程改造以防止接合fcγ受体来产生这些抗体。与本领域中可用的bma031之人源化形式不同，根据所述实施方案之抗体保持bma031之结合亲和力。此外，如体外驯化(education)测定法中所示，根据所述实施方案的抗体之免疫抑制性质优于bma031。而且，与现有技术之人源化bma031抗体不同，根据所述实施方案的抗体不在正常pbmc中诱导细胞因子释放。
18、根据第五方面，提供包含经修饰fc之抗体，其中该经修饰fc包含减少fcγr受体结合之经修饰的糖基化模式，该抗体包含突变s298n、t299a及y300s中之一或多者。
19、在一个实施方案中，抗体包含突变n297q、s298n、t299a及y300s中之两者或更多者。
20、在实施方案中，抗体包含多重突变n297q/s298n/y300s、s298n/t299a/y300s或s298n/y300s。
21、例如，抗体可为如本发明前述方面中所述之抗体。
22、根据第六方面，提供多特异性抗体，其至少包含如本发明前述方面中所述第一结合域之重链及对肿瘤特异性抗原具有特异性之第二结合域。
23、在一个实施方案中，第一结合域包含根据本发明第二方面之重链。
24、多特异性抗体可包含许多不同构型；在一个实施方案中，其包含抗tcr/cd3 scfv及抗肿瘤scfv。
25、在一个实施方案中，多特异性抗体具有双特异性。
26、具体地，本发明涉及如下各项：
27、1.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:7、12或13中所述的cdr及seq id no:17中所述的人类igh3-23框架，其中框架位置6是供体残基。
28、2.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:7、12或13中所述的cdr及seq id no:17中所述的人类igh3-23框架，其中框架位置18是供体残基。
29、3.根据项1或2的对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其中框架位置49和/或69是供体残基。
30、4.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:15或16中所述的cdr及seq id no:18中所述的人类ighv1-3*01框架，其中框架位置38、44和/或48中的一或多者是供体残基。
31、5.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:15或16中所述的cdr及seq id no:18中所述的人类ighv1-3*01框架，其中框架位置44及48是供体残基。
32、6.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:14中所述的cdr及seq id no:19中所述的人类igkv3-11*01框架，其中框架位置70和/或71是供体残基。
33、7.根据项6的对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其中框架位置46是供体残基。
34、8.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含seq id no:7、seq id no:12及seq idno:13中所述氨基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含seq id no:14中所述氨基酸序列。
35、9.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含seq id no:15及seq id no:16中所述氨基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含seq id no 14中所述氨基酸序列。
36、10.根据任何前一项的人源化抗体，其进一步包含人类来源的恒定区。
37、11.根据项10的人源化抗体，其进一步包含减少fcγ受体结合的fc修饰。
38、12.根据项11的人源化抗体，其包含非糖基化fc区或δab修饰。
39、13.根据项11的人源化抗体，其包含经修饰的糖基化模式。
40、14.根据项13的人源化抗体，其包含突变s298n、t299a及y300s中的一或多者。
41、15.根据项14的人源化抗体，其包含突变n297q、s298n、t299a及y300s中的两者或更多者。
42、16.根据项14的人源化抗体，其包含多重突变n297q/s298n/y300s、s298n/t299a/y300s或s298n/y300s。
43、17.一种核酸，其至少编码根据项1至16中任一项的人源化单克隆抗体的重链可变区。
44、18.一种细胞，其表达根据项17的核酸。
45、19.根据项1-16中任一项的人源化抗体，其用于抑制受试者中的t细胞介导的反应。
46、20.根据项19的人源化抗体，其中该t细胞介导的反应参与选自以下的状况：组织移植(tissue transplantation)，包括实体器官移植及复合性组织移植，组织移植(tissuegrafting)、多发性硬化及1型糖尿病。
47、21.一种包含经修饰fc的抗体，其中该经修饰fc包含减少fcγ受体结合的经修饰糖基化模式，该抗体包含突变s298n、t299a及y300s中的一或多者。
48、22.根据项21的抗体，其包含突变n297q、s298n、t299a及y300s中的两者或更多者。
49、23.根据项14的抗体，其包含多重突变n297q/s298n/y300s、s298n/t299a/y300s或s298n/y300s。
50、24.根据项21-23中任一项的抗体，其中该抗体是根据项1至10中任一项的人源化抗体。
51、25.一种多特异性抗体，其至少包含根据项1至9中任一项的第一结合域的重链和对肿瘤特异性抗原具有特异性的第二结合域。
52、26.根据项25的多特异性抗体，其至少包含根据项4、5或9中任一项的结合域的重链。
53、27.根据项25或项26的多特异性抗体，其包含抗αβtcr/cd3 scfv及抗肿瘤scfv。
54、28.根据项25-27中任一项的多特异性抗体，其具有双特异性。
1.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:7、12或13中所述的cdr及seq id no:17中所述的人类igh3-23框架，其中框架位置6或18是供体残基。
2.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:15或16中所述的cdr及seq id no:18中所述的人类ighv1-3*01框架，其中框架位置38、44和/或48中的一或多者是供体残基。
3.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:15或16中所述的cdr及seq idno:18中所述的人类ighv1-3*01框架，其中框架位置44及48是供体残基。
4.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:14中所述的cdr及seq id no:19中所述的人类igkv3-11*01框架，其中框架位置70和/或71是供体残基。
5.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含seq id no:7、seq id no:12及seq id no:13中所述氨基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含seq id no:14中所述氨基酸序列。
6.一种对人类αβtcr/cd3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含seq id no:15及seq id no:16中所述氨基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含seq id no 14中所述氨基酸序列。
7.一种核酸，其至少编码根据权利要求1至6中任一项的人源化单克隆抗体的重链可变区。
8.一种细胞，其表达根据权利要求7的核酸。
9.一种包含经修饰fc的抗体，其中该经修饰fc包含减少fcγ受体结合的经修饰糖基化模式，该抗体包含突变s298n、t299a及y300s中的一或多者。
10.一种多特异性抗体，其至少包含根据权利要求1至6中任一项的第一结合域的重链和对肿瘤特异性抗原具有特异性的第二结合域。
