本发明涉及微生物核酸提取，具体涉及一种核酸纯化装置及其在原油和/或稠油中微生物总dna提取中的应用。
背景技术：
1、分子生物学领域，环境样品微生物dna提取是研究微生物群落特征的重要途径，如何高效率地分离和纯化是dna提取技术里的一项关键内容。利用核酸纯化柱对微生物dna进行分离和纯化一直是dna提取技术里的常用的手段之一，也是目前市面上商业化试剂盒所使用最多的方法。
2、市面上常见的核酸纯化柱柱体为一端带盖圆柱体管状结构：带盖的长度约为4cm的空心圆柱体结构(外径约1cm)，底部为核酸吸附膜。核酸纯化柱柱体嵌套在另一无盖且长度约为3cm的空心圆柱体(收集管)，收集管直径略大于核酸纯化柱柱体，一般将两部分合称为核酸纯化柱。通常的核酸纯化柱法提取dna的一般流程是，先通过化学试剂或生物酶制剂裂解细胞，得到粗提的dna溶液，再将此溶液转移到核酸纯化柱中进行纯化操作，以除去细胞碎片和朊等杂质。
3、然而，对于原油等一些极端环境样品而言，其中微生物的含量低，且黏稠性使普通纯化柱的局限性凸显。第一，在便捷性方面，以原油样品为例，获取相同较大质量的dna，需要数十倍增加重复提取次数，使实验操作更加繁琐，且放大人为误差；第二，在时效方面，需要重复多次普通核酸纯化装置的过滤分离步骤，原本生物量大的样本只需5-10min的纯化步骤会因反复操作延长至1h；第三，在核酸质量和纯度方面，原油黏稠且低密度的特点使得原油油相杂质易附着和难祛除，这一点对于一般核酸纯化柱纯化功能影响较大；第四，在经济性方面，“少量多次”的特点使得传统的一次性核酸纯化柱在应用到大体积样本时消耗量极大，且容易产生核酸环境污染，而对于低生物量样本则需消耗投入更多。综上所述，普通核酸纯化装置对包括原油在内的极端环境样品的适用性较差。
4、因此，本领域亟需开发一种原油等极端环境样品的核酸纯化装置，以简化此类核酸分离纯化操作流程和提高其效率。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了克服普通核酸纯化装置的不足，进一步增强原油dna提取效果，本发明旨在设计一种针对原油和/或稠油中微生物总dna提取的核酸纯化装置。
2、本发明的目的还在于设计这种针对原油和/或稠油样品的核酸纯化装置，以适配本单位发表的专利号为zl 201710116846.5(cn106754895b)的发明专利《提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒》和《提取稠油基因组脱氧核糖核酸试剂盒制备及其应用》(pct/cn2019/104518)的两种提取原油总脱氧核糖核酸的专利方法，用以进一步提高对原油和/或稠油样品中微生物总dna的提取效率。
3、为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种核酸纯化装置，所述核酸纯化装置由四部分组成，分别是粗滤柱、纯化柱、第一收集管和第二收集管；
4、所述粗滤柱、所述纯化柱、所述第一收集管和所述第二收集管能相互稳定容纳或扣合，形成一个整体；其中，所述第二收集管、所述纯化柱和所述粗滤柱依次由外到内设置并相互嵌合，所述纯化柱与所述第一收集管串联于所述第二收集管内的上下部分。
5、优选地，以现有商用离心机的离心转头(适配50ml及100ml离心管)为模板设计有关尺寸，所述核酸纯化装置包括粗滤柱、纯化柱、第一收集管和第二收集管，所述核酸纯化装置的顶端为加样口，加样口配备螺母盖式密封盖，加样口内径为32mm，密封塞以下为所述粗滤柱，样本经过所述粗滤柱过滤后进入纯化柱，再经由所述纯化柱二次过滤后进入所述第一收集管，得到dna溶液。
6、优选地，所述第一收集管和第二收集管的结构分别与所述纯化柱的结构相适配：所述第二收集管的内径与所述纯化柱的上部外径相同以使所述纯化柱能够紧扣所述第二收集管的内壁且接触表面由磨砂面制成，以防止所述纯化柱倾斜或自由转动；所述第一收集管的内径与所述纯化柱的下部外径相同以使核酸所述纯化柱能够紧扣所述第一收集管的内壁且接触表面由磨砂面制成，以防止所述纯化柱倾斜或自由转动；所述两次过滤的过滤膜的结构分别与所述粗滤柱和所述纯化柱的结构相适配，以使所述过滤膜分别稳定嵌套于所述粗滤柱和所述纯化柱的底部。
7、优选地，本发明的所述核酸纯化装置，包括四个相互独立，同时又能相互紧密扣合的主要组分，第一部分为粗滤柱；第二部分为纯化柱，所述粗滤柱由所述纯化柱衔接且包裹；第三部分为第一收集管，所述第一收集管紧接所述纯化柱的底端；第四部分为第二收集管；所述第二收集管整体包裹着第一、第二和第三部分，以及配套的螺母盖式密封盖。
8、优选地，第一部分的粗滤柱为圆柱型构造，上端为装置总加样口(无盖)，下端以过滤膜为底，粗滤柱置于第二部分的纯化柱中时可以紧密贴合纯化柱内壁，纯化柱同时也能紧密贴合于第二收集管内壁并嵌合第一收集管将其稳固限位于第二收集管和纯化柱之间，这四部分能够同时紧扣组合为一整体。粗滤柱下部为滤膜，截留难溶性杂质、不与dna发生特异性结合，滤膜直径为32mm，纯化柱底端装配吸附膜，可特异性吸附dna，直径为6mm。
9、优选地，所述粗滤柱、所述纯化柱、所述第一收集管和所述第二收集管均为类似的圆柱体构造，且三者的外径和内径依次相贴合，由内到外(或内径由小到大)分别为第一收集管、粗滤柱、纯化柱和第二收集管，通过内外管壁相接处的磨砂表面相互作用，使得四部分能够稳固地接合在一起，并可自由拆卸取出。
10、优选地，第一部分的粗滤柱的底部为除去原油难溶性杂质粗滤膜，第二部分的纯化柱为纯化核酸的吸附膜。
11、优选地，所述核酸纯化装置的大容量和双过滤构造使得对于普通的环境样品一般核酸纯化系统需要重复多次操作才能完成的微生物核酸提取目标可由为单次操作一步完成。
12、优选地，本发明提供的所述核酸纯化装置，对于原油等这类极端环境样品微生物脱氧核糖核酸的提取，可以大大提高对其微生物核酸的富集效果，从而提高提取效率。
13、优选地，本发明提供的所述核酸纯化装置的内部增设小型的第一收集管可避免小体积的目标dna溶液在大体积的第二收集管中因移液保存而造成的相对损失量过大的问题。
14、本发明的第二方面提供第一方面所述的原油和/或稠油中微生物总dna提取的核酸纯化装置在核酸提取中的应用，所述应用中的所述核酸提取包括以下提取步骤：
15、(1)取体积20-30ml的样本；所述样品为原油样本和/或稠油样本；
16、若所述样本为低生物量样本ⅰ，则将所述样本i进行离心处理弃去上清液保留沉淀物；所述样本ⅰ为极端环境样本(原油(轻质油(lo)、中质油(mo)、普通稠油(oho)、特稠油(eho)、超稠油(sho)、地层水等样本)；
17、若所述样本为固态化程度较高的样本ⅱ，则将所述样本ii进行研磨或碎片化的前处理；所述样本ⅱ为土壤(含高盐碱性土壤)、岩石矿物；
18、(2)依次加入20-30ml提取缓冲液、500-750μl冲液酶i、500-750μl冲液酶ii和5-7.5ml去污液，65℃恒温30-45min，然后90℃恒温30-45min，第一离心3-5min后转移下清液至新的离心管；所述第一离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
19、加入与上层液等体积的朊沉淀液，第二离心5-10min；所述第二离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
20、(3)将所述核酸纯化装置中的粗滤柱、纯化柱和第二收集管三部分组合，得到组合结构；
21、将所述第二离心收集的上清液全部转移至所述组合结构中的粗滤柱，第三离心5-10min，弃去所述第二收集管中的废液并放回至所述第二收集管；其中，所述上清液的体积为20-30ml；所述第三离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
22、(4)弃去所述粗滤柱并向所述纯化柱中加入1ml预冷的漂洗液进行漂洗，第四离心5-10min弃去所述第二收集管中的废液，重复漂洗步骤一次；所述第四离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
23、将所述纯化柱于室温下放置10-20min，以晾干吸附膜中残余的漂洗液；
24、(5)最后在所述纯化柱的底部放入第一收集管，向所述纯化柱的吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl的dna洗脱液，室温下静置5-10min，第五离心3-5min，得到原油和/或稠油中微生物总dna；所述第五离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g。
25、优选地，所述应用中的所述核酸提取包括以下提取步骤：
26、(1)取体积20-30ml的样本；所述样品为原油样本；
27、若所述样本为低生物量样本ⅰ，则将所述样本i进行离心处理弃去上清液保留沉淀物；所述样本ⅰ为极端环境液体样本；
28、若所述样本为固体样本ⅱ，则将所述样本ii进行研磨或碎片化的前处理；所述样本ⅱ为极端环境土壤、岩石矿物；
29、(2)依次加入20-30ml提取缓冲液、500-750μl冲液酶i、500-750μl冲液酶ii和5-7.5ml去污液，65℃恒温30-45min，然后90℃恒温30-45min，第一离心3-5min后转移下清液至新的离心管；所述第一离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
30、加入与上层液等体积的朊沉淀液，第二离心5-10min；所述第二离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
31、(3)将所述核酸纯化装置中的粗滤柱、纯化柱和第二收集管三部分组合，得到组合结构；
32、将所述第二离心收集的上清液全部转移至所述组合结构中的粗滤柱，第三离心5-10min，弃去所述第二收集管中的废液并放回至所述第二收集管；其中，所述上清液的体积为20-30ml；所述第三离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
33、(4)弃去所述粗滤柱并向所述纯化柱中加入1ml预冷的漂洗液进行漂洗，第四离心5-10min弃去所述第二收集管中的废液，重复漂洗步骤一次；所述第四离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g；
34、将所述纯化柱于室温下放置10-20min，以晾干吸附膜中残余的漂洗液；
35、(5)最后在所述纯化柱的底部放入第一收集管，向所述纯化柱的吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl的dna洗脱液，室温下静置5-10min，第五离心3-5min，得到原油和/或稠油中微生物总dna；所述第五离心的相对离心力为12298×g-17709.12×g。
36、需要说明的是，在步骤(1)中，所述“低生物量样本”是指极端环境样本。
37、优选地，本发明提供的核酸纯化装置在核酸提取中的应用，适用于一般生物量较低的环境样品，以本单位发表的专利cn106754895b公开的一种提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒为例，且简化其中的提取过程，用以进一步提高对原油样品微生物dna的提取效率，具体提取方法步骤及试剂配比参考上述专利，对步骤三进行一定程度地修改以适配本核酸纯化装置。
38、根据一种特别优选的具体实施方式，对所述步骤三的具体变更如下：
39、步骤三：按照本发明的核酸纯化装置，组合粗滤柱、纯化柱和第二收集管三部分，将所述第二离心收集的上清液全部(约20-30ml)转移至组合好的核酸纯化装置中的粗滤柱，室温离心(12298×g-17709.12×g)5min，弃去第二收集管中的废液并放回第二收集管，然后弃去装置的第一部分的所述粗滤柱并向所述纯化柱中加入1ml预冷的漂洗液进行漂洗，于12298×g-17709.12×g相对离心力条件下第三离心5min去除废液，重复漂洗步骤一次；将所述纯化柱于室温下放置10-20min，以晾干吸附柱中吸附膜中残余的漂洗液；最后在所述纯化柱的底部放入所述第一收集管，向所述纯化柱中的吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl的dna洗脱液，室温下静置5-10min，于相对离心力为12298×g-17709.12×g的条件下第五离心2-3min，第一收集管中所得离心后滤液即为原油和/或稠油中微生物总dna(即脱氧核糖核酸)。
40、优选地，酶制剂及化学制剂(冲液酶i、冲液酶ii、提取缓冲液、去污液、朊沉淀液、漂洗液和dna洗脱液)的成分及配比参考专利cn106754895b。
41、本发明的上述技术方案相对于现有技术至少具有以下有益效果：
42、本发明所述的核酸纯化装置包括四个独立但又能组合在一起的部分：粗滤柱、纯化柱、第一收集管和第二收集管。由于粗滤柱、核酸样品制备柱和第一收集管均为相似的圆柱体构造，且三者的内外径依次相适配，其大容量和双过滤构造通过密封塞和收集管(第一收集管和第二收集管)保持部件的作用，使得四部分结构可稳固地接合在一起，使得对于普通的环境样品一般核酸纯化系统需要重复多次操作才能完成的微生物核酸提取目标可在较大程度减少dna溶液损失的情况下由单次操作一步完成。当需要进行原油等这类极端环境样品微生物脱氧核糖核酸的批量化提取时，本发明实验连续性和半自动化性功能的使原本大量的、重复的连续实验操作能够有效的被减少，同时大大降低多次连续重复操作时产生的人为误差和偶然误差，本发明大大提高了对其微生物核酸的富集和纯化效果，从而提高大大提取效率。另外也能大量减少一般一次性核酸纯化柱的使用，减少了资源的浪费和成本投入。
1.一种核酸纯化装置，其特征在于，所述核酸纯化装置由四部分组成，分别是粗滤柱(100)、纯化柱(200)、第一收集管(300)和第二收集管(400)；
2.根据权利要求1所述的核酸纯化装置，其特征在于，所述粗滤柱(100)包括粗滤柱(100)本体和滤膜(101)；和/或，
3.根据权利要求1所述的核酸纯化装置，其特征在于，所述第一收集管(300)为一连体卡扣式带盖小型离心管；和/或，
4.根据权利要求1所述的核酸纯化装置，其特征在于，所述第二收集管(400)为可拆卸螺母式盖的大型离心管；和/或，
5.权利要求1-4中任意一项所述的核酸纯化装置在原油中微生物总dna提取中的应用，其特征在于，所述应用中的所述核酸提取包括以下提取步骤：
