本发明属于毒性评价，具体涉及一种符合ich s5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法及应用。
背景技术：
1、发育毒性和致畸性是一个严重的安全性问题，致畸剂导致人类新生儿约5-10％的先天性异常。在1966年沙利度胺对发育的影响被确认后，美国食品和药物管理局(fda)在人类使用前建立了用于评估关于生殖和发育药物效果的方案。此外，目前有超过143835种预先记录在册的化学品可能污染食品和环境，但约86％的这些化学品和其他现有化学品没有安全测试数据。
2、由于对化学品安全性的担忧，reach计划建立收集每年所有生产或销售数量超过1吨的化学品的此类数据的协议。据估计，需要评估一个样品的发育毒性需要5816只传统测试动物和1883200英镑的成本，根据化学经济合作与发展组织(oecd)的指导方针，这种情况促使研究发育毒性试验的替代方法，即全胚胎培养(wec)试验、胚胎细胞微团培养试验(mm)，和胚胎干细胞试验。前两种模型仍然使用完整的哺乳动物作为测试系统；后一种一直是一个有争议的领域。但是，上述测试并不涵盖胚胎发育的整个阶段。
3、斑马鱼作为一种非哺乳脊椎动物，在替代毒性检测方面具有若干优势，如经济养殖要求、胚胎透明、高繁殖力和可进行6-384孔板高通量筛选，此外，斑马鱼似乎也是发育毒性测试的适用模型，过去10年，药物和化合物的发育毒性实际上已经在斑马鱼中进行了评估，如表1所示。在4个实验室进行的一项盲法研究中，在斑马鱼身上测试了20种非专利化合物的发育毒性；每个测试实验室都取得了与哺乳动物数据相似的总体一致性。在优化实验参数和考虑斑马鱼胚胎吸收的基础上，在两个实验室对38个专利药物化合物进行了评价；总一致性达到62-82％。在其他研究中，在佛兰德斯技术研究所和phylonix制药公司，斑马鱼发育毒性分析的总体预测值分别为50-60％和92％。明显可以看出，这些来自斑马鱼试验的发育毒性报告并不统一：致畸性的定义、结果的可预测性、与实验条件和数据分析相关的多个细节以及浓度设置的合理性都没有得到充分优化和验证。
4、表1.已经报道的斑马鱼发育毒性与致畸性的评估方案
5、
6、国际人用药品注册技术要求协调会(ich)协调指南s5(r3)(2020年)的发布和实施正在推动着中国发育毒性试验替代方法的进步。在中国国家药监局参与ichs5(r3)的修订，其中引入替代测试系统是一个大的更新，也是第一次在ich安全性系列指南中大量增加替代试验方法的内容。
7、ich指南建议使用替代体外和非哺乳动物体内生殖试验用于胚胎-胎儿发育毒性(efd)风险评估。ich s5(r3)终版本(2020年)明确指出，从单独进行或与一项或多项体内研究结合进行的合格替代测定所产生的数据可用于支持在有限情况下的危害识别和风险评估。然而，斑马鱼发育毒性试验产生的数据已在国内外用于研究性新药(ind)申请。
技术实现思路
1、针对上述背景技术中出现的问题，本发明设计的目的在于提供一种符合ichs5指南要求的斑马鱼药物发育毒性评价方法及应用，具体通过以下技术方案加以实现：
2、ichs5(r3)指导下斑马鱼药物发育毒性评价方法，包括以下步骤：
3、1)斑马鱼饲养及卵的收集：斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/lcaco3)；收集自然交配产生的斑马鱼胚胎，收集年龄为受精后4-6h(4-6hpf)；
4、2)验证化合物的选择：选择ichs5指导原则中阳性、阴性参考化合物列表中的至少45种化合物(涵盖了该参考化合物列表中的所有类别)；待验证化合物中用于检测阳性和用于检测阴性的化合物比例约为2:1；
5、3)化合物暴露方法：将6hpf的斑马鱼胚胎转移到含有阴性化合物、阳性化合物、溶剂对照(0.5％dmso溶液)或正常对照(养鱼用水)的24孔板中进行暴露，1ml/孔，1尾/孔，样品连续处理斑马鱼5天至5dpf，期间每天观察胚胎的发育情况并及时移除死亡斑马鱼。在体视显微镜下，在48hpf(受精后2天，dpf)和120hpf(5dpf)下评估每个斑马鱼个体的形态特征；假阳性、假阴性和未分类的化合物至少重复一次；
6、4)25％致死浓度(lc25)和未观察到不良反应水平(noael)的测定：根据2dpf和5dpf时的累计死亡率，分别计算25％致死浓度lc25；若最高检测浓度下的致死率<25％，则在后续应用中默认设置lc25值高于最高检测浓度；noael的确定涉及评估异常效应的浓度及反应关系，noael引起的异常表型应等于或低于溶剂和正常对照中观察到的表型，分别在2dpf和5dpf观测得到2个noael值；
7、5)发育毒性形态评估：以2dpf和5dpf评估斑马鱼的发育毒性；样品暴露处理后，用3％甲基纤维素固定斑马鱼，利用体视显微镜相机或图像采集系统拍摄形态学异常，用于发育毒性形态评估；
8、6)致畸性及致畸指数(ti)计算，具体步骤为：
9、步骤a:经典方案ti计算
10、根据5dpf的noael和lc25值，计算ti，即lc25/noael的比值，在经典方案中，根据5dpf的ti值将化合物分为非致畸物和致畸物；
11、步骤b:优化方案ti计算(仅用于不确定的可疑受试物)
12、经典方案的优化包括在2dpf处计算额外的ti值，增加一个未分类化合物的新类别，缩小在初始测试中确定的某些化合物的测试浓度范围，并提出新的致畸性判断标准。进一步地，发育毒性评估中，包括评估的组织和器官，具体包括心脏、循环、出血/血栓形成、头部、咽弓/下巴、眼睛、囊/耳石、肝脏、肾脏、鱼鳔、肠道、脊索/体节/尾部、躯干肌肉、胸鳍和身体色素沉着。
13、进一步地，步骤a)中，5dpf中ti值≥10代表化合物被预测为诱发致畸；ti值<10，化合物被预测为非致畸物；由于浓度为>1000μm而无法确定lc25/nooael比值的化合物被预测为非致畸物。
14、进一步地，步骤b)中优化后的致畸判断标准为：
15、(1)基于经典方案的计算方法
16、在2dpf或5dpf时，ti值≥10的ti值代表致畸化合物；为减少可能的假阴性结果，对斑马鱼表现出明显形态异常但ti值<10的化合物被归类为未分类化合物；
17、(2)在经典方案试验中鉴定出的未分类和假阳性化合物，使用优化后的更小的试验浓度范围进一步重新试验，以获得更准确的lc25和noael；使用originpro 8.0软件计算浓度-死亡率曲线，得到2dpf和5dpf时的lc25和noael，获得更精确的ti值；如果在2dpf或5dpf的ti≥3，这些化合物在精确浓度下重新测试被判定为致畸物，否则判定为非致畸物。
18、ichs5(r3)指导下斑马鱼药物发育毒性评价方法在斑马鱼作为一种替代的体内方法来筛选和评估候选药物的致畸性方面的应用。
19、本发明在经典方案5dpfti的基础上添加了一个额外的2dpf ti值后，对斑马鱼表现出明显形态异常但ti值<10的化合物被归类为一个新的分类——“未分类化合物”；对未分类或可疑阳性化合物，细化了测试浓度范围，并将ti判定值从≥10优化到≥3。优化后的斑马鱼发育试验灵敏度由74.2％(23/31，阳性化合物在斑马鱼中具有致畸性)提高到90.3％(28/31)，总体可预测性由77.8％(35/45)提高到88.9％(40/45)。
1.符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法，其特征在于发育毒性形态评估中，包括评估的组织和器官，具体包括心脏、循环、出血/血栓形成、头部、咽弓/下颌、眼睛、耳石、嗅觉区域、肝脏、肾脏、鱼鳔、肠道、脊索/体节/尾部、躯干肌肉、鳍、身体色素沉着和卵黄囊。
3.如权利要求1所述的符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法，其特征在于步骤1)中，养鱼用水的水质为：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/l caco3。
4.如权利要求1所述的符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法，其特征在于致畸性及致畸指数计算步骤a)中，5dpf中ti值≥10代表化合物被预测为致畸物；ti值<10，化合物被预测为非致畸物；由于浓度为>1000μm而无法确定lc25/nooael比值的化合物被预测为非致畸物。
5.如权利要求1所述的符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法，其特征在于致畸性及致畸指数计算步骤b)中优化后的致畸判断标准为：
6.权利要求1-5任一所述的符合ichs5(r3)指导原则替代试验要求的斑马鱼药物发育毒性优化评价方法在斑马鱼模型作为一种传统哺乳动物体内胚胎-胎仔发育毒性试验(efd)的替代方法来筛选和评估候选药物的发育毒性、致畸性方面的应用。
