本发明属于中药制剂检测，具体地说，涉及一种三七总皂苷的提取方法及检测方法。
背景技术：
1、三七为贵重药材，主要用于散瘀止血、消肿定痛。三七中药效成分主要是人参皂苷和三七皂苷，其对心脑血管系统具有广泛的药理活性。三七含量测定指标主要为三七总皂苷的五种组分：三七皂苷r1、人参皂苷rg1、re、rb1和rd。
2、灯银脑通全方由灯盏细辛、银杏叶、满山香、三七四味中药组成，原名“脑瘫灵”，在该方基础上开发出的现有品种灯银脑通胶囊，具有行气活血，散瘀通络的功效，主要用于治疗中风、偏瘫、动脉硬化等疾病，并对痴呆症具有一定的防治效果。开发成上市药品的灯银脑通胶囊具有行气活血、散瘀通络的功效，临床主要用于治疗缺血性脑卒中。
3、由于灯银脑通胶囊由灯盏细辛、银杏叶、满山香及三七等药材提取精制而成，为中药复方制剂，成分复杂，处方中三七加入量仅为处方量的11.7％，制得的制剂中三七总皂苷中五个组分含量较低，尤其是三七特征成分三七皂苷r1、人参皂苷re和人参皂苷rd含量较微。
4、通常，三七总皂苷中组分含量测定的主要提取溶剂体系为甲醇或甲醇-水混合溶剂。常用的提取方式包括两种：(1)直接超声提取，之后直接用于检测；(2)先用甲醇提取后回收甲醇，残渣用水饱和的正丁醇溶液对三七总皂苷进行萃取，回收溶剂后残渣再用甲醇溶解进行测定。
5、然而，在灯银脑通胶囊三七薄层鉴别和含量测定研究中发现，甲醇提取法不仅可提取三七总皂苷中组分，还能提取其他干扰成分，例如鞣质类、萜类、黄酮类、黄酮醇类和有机酸类等其他多种成分，用水饱和的正丁醇溶液也不能针对性地萃取到总皂苷组分，达不到除杂提纯的目的，检测时受到的干扰较大，导致灯银脑通胶囊三七薄层鉴别时组份互扰，无法清晰识辩斑点，而在含量测定时杂质还影响分离度，造成干扰峰较多，目标峰不能准确定量，影响检测结果的专属性和准确性。
6、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种三七总皂苷的提取方法及检测方法，可避免三七总皂苷在提取时受其他组分干扰导致的分离困难、需要进一步纯化的问题，提取得到的供试品溶液可用于进一步检测，所得检测结果更加准确。
2、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
3、一种三七总皂苷的提取方法，包括：将待测样品溶解后上样至c18固相萃取小柱，然后采用甲醇-氨水溶液淋洗，弃去淋洗液；之后用水冲洗至中性，再加甲醇洗脱，收集洗脱液，即得含有三七总皂苷的供试品溶液。
4、在三七提取物或含有三七的中药制剂中，尤其是复方中药制剂中，成分非常复杂，甲醇直接提取会得到非常多的杂质组分，干扰后续的检测过程。研究发现，需要提取的目标成分三七总皂苷中，五种组分均为中性物质，而其它可被甲醇提取到的黄酮类、黄酮醇类和有机酸类等干扰成分大多都带有显弱酸性的基团。上述方案中采用c18固相萃取小柱进行提取，并通过甲醇-氨水溶液进行淋洗，利用甲醇-氨水溶液的碱性特性，可实现有效的除杂作用，纯化样品中的目标成分，最终由甲醇富集目标成分，可以得到干扰成分较少，甚至几乎无干扰成分的供试品溶液。
5、本发明中，所得供试品溶液可用于三七的鉴别、含量测定等后续的检测，由于供试品溶液中的干扰成分含量大幅度降低，可以明显改善检测结果的准确性。
6、进一步地，所述的甲醇-氨水溶液中，甲醇的体积浓度为30％～36％，优选为36％。
7、进一步地，采用体积浓度为0.1％～2％的氨水溶液与甲醇混合，得到所述的甲醇-氨水溶液；
8、优选地，所述氨水溶液的体积浓度为0.1％～1％。
9、在上述方案中，所述氨水溶液由市售分析纯的氨水(质量浓度为25％～28％)和纯水混合得到，所述的体积浓度是指配制所述氨水溶液时，所使用的氨水的体积占所得氨水溶液体积的百分比。例如，体积浓度为1％的氨水溶液是由1ml分析纯的氨水加水稀释至100ml得到的。
10、本发明中，经研究发现，采用体积浓度为0.1％～2％的氨水溶液所配制得到的甲醇-氨水溶液，对c18固相萃取小柱淋洗的除杂能力基本一致，都可以大幅度地除去干扰成分，避免供试品溶液中干扰成分的存在对后续的检测结果造成影响。而如果所采用氨水溶液的体积浓度过高，在利用甲醇-氨水溶液对c18固相萃取小柱淋洗之后，后续需要大量的水才可以冲洗至中性，不利于提取过程的高效进行。
11、进一步地，采用10～30ml的甲醇-氨水溶液进行淋洗，优选采用15ml的甲醇-氨水溶液进行淋洗。
12、进一步地，所述待测样品为三七提取物；精密称量所述提取物，加水后进行超声处理10～60min，然后进行离心处理，取离心液至c18固相萃取小柱，上样；优选地，配制含所述三七提取物为6～25mg/ml的溶液进行超声处理。
13、具体地，本发明中，精密称量所述三七提取物0.18～0.75g，优选称量0.4g，然后加30ml水进行超声处理。
14、或者，所述待测样品为灯银脑通胶囊；倾出所述灯银脑通胶囊的内容物，研磨后精密称量，加水后进行超声处理10～60min，然后进行离心处理，取离心液至c18固相萃取小柱，上样；优选地，配制含所述内容物为13～50mg/ml的溶液进行超声处理。
15、具体地，本发明中，精密称量研磨后的内容物0.4～1.5g，优选称量1g，然后加30ml水进行超声处理。
16、三七总皂苷的5个组分均易溶于水，且水样溶液更容易将组分上样至c18固相萃取小柱上。因此，在上述方案中选择水作为第一步提取溶剂，可以使待测样品中需要提取的目标成分充分上样至c18固相萃取小柱，并最终提取至供试品溶液中，避免提取过程中目标成分的损失。
17、进一步地，取离心液5ml至c18固相萃取小柱，上样；经过甲醇-氨水溶液淋洗和水冲洗后，加甲醇洗脱至收集洗脱液5ml。
18、进一步地，上样之前对所述c18固相萃取小柱进行预处理，包括：
19、采用10～20ml甲醇对c18固相萃取小柱进行洗脱，再用水洗脱；或者，采用甲醇对c18固相萃取小柱浸泡至少0.5小时，再采用5～20ml甲醇对浸泡后的c18固相萃取小柱进行洗脱，然后用水洗脱。
20、具体地，当采用甲醇先浸泡、再洗脱的预处理方式时，可以采用甲醇对c18固相萃取小柱浸泡过夜，然后再用5～20ml新的甲醇进行洗脱。甲醇直接洗脱，或先浸泡、再洗脱之后，用水洗脱至无醇味，则预处理完成。
21、在上述方案中，通过对c18固相萃取小柱进行预处理，可以除去小柱中可能存在的杂质，并创造一定的溶剂环境。
22、本发明还提供了一种三七总皂苷的检测方法，采用上述所述的三七总皂苷的提取方法制备含有三七总皂苷的供试品溶液，然后利用所述供试品溶液进行鉴别和/或含量测定。
23、在上述方案中，由于供试品溶液制备过程中，通过甲醇-氨水溶液淋洗充分去除了干扰成分，再由甲醇富集目标成分进行检测，显著提高了检测方法的专属性、准确度和耐用性。
24、进一步地，进行鉴别包括：
25、取三七总皂苷对照品，加甲醇配制成总皂苷对照品溶液；
26、吸取等量的供试品溶液和总皂苷对照品溶液，分别点于同一硅胶g薄层板上，以展开剂展开；
27、晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
28、所述的展开剂为二氯甲烷-无水乙醇-水的混合溶剂，其中二氯甲烷、无水乙醇混和水的体积比为70：45：6.5；
29、优选地，所述展开剂配制完成后，在展开缸中饱和10～30min，优选饱和30min，再放入点有供试品溶液和对照提取物溶液的硅胶g薄层板；
30、较佳地，展开时的展距为9～15cm；优选地，展距为12cm。
31、优选地，所述对照提取物溶液的浓度为2.5mg/ml。
32、具体地，本发明中，吸取所述供试品溶液和对照提取物溶液各3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，放入展开缸中以展开剂展开后，取出，晾干，然后喷以硫酸体积浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
33、在上述方案中，所得供试品溶液的薄层色谱中，在与对照提取物溶液的薄层色谱对应的位置上，显出相同颜色的斑点，即说明所述供试品溶液中含有相应的组分。所得的薄层色谱中，对应不同组分的斑点明显分离，肉眼即可清晰分辨对应不同组分的显色斑点，鉴别更加准确。
34、进一步地，采用高效液相色谱法进行含量测定，色谱条件包括：
35、色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；
36、以乙腈为流动相a，以水位流动相b，进行梯度洗脱；
37、所述梯度洗脱按如下程序进行：
38、0分钟，20％流动相a，80％流动相b；
39、30～35分钟，20％流动相a，80％流动相b；
40、50分钟，34％流动相a，66％流动相b；
41、60分钟，48％流动相a，52％流动相b；
42、75分钟，97％流动相a，3％流动相b；
43、82分钟，97％流动相a，3％流动相b；
44、优选地，所述梯度洗脱按如下程序进行：
45、0分钟，20％流动相a，80％流动相b；
46、30分钟，20％流动相a，80％流动相b；
47、50分钟，34％流动相a，66％流动相b；
48、60分钟，48％流动相a，52％流动相b；
49、75分钟，97％流动相a，3％流动相b；
50、82分钟，97％流动相a，3％流动相b。
51、本发明中，由于供试品溶液中去除了大部分干扰成分，采用高效液相色谱法测得的色谱图中，干扰峰显著减少，更容易清晰辨认出属于三七总皂苷的五个目标峰，同时避免了目标峰不能准确定量，导致含量检测不精确的问题。
52、此外，三七总皂苷含量测定的关键主要是要保证人参皂苷rg1和re各自出峰的分离度能满足要求，而现有大部分采用高效液相色谱法进行的三七总皂苷含量测定中，人参皂苷rg1和re的保留时间会随着色谱柱的差异出现较为明显的差别，分离度也难以得到保障，影响这两个组分的准确定量。在上述方案中，通过优化梯度洗脱程序，尤其是延长了初始等梯度阶段的时长，使得rg1和re的出峰保持在等梯度阶段，可以保证两个组分在所得色谱图中分离度，提高对该两个组分的定量准确性。
53、进一步地，所述色谱条件还包括：流速为1.3～1.5ml/min，色谱柱的柱温为25℃，检测波长为203nm，进样量为10μl。
54、进一步地，所述色谱柱的柱长为25cm，内径为4.6mm，所述填充剂的粒径为5μm。
55、进一步地，进行含量测定具体包括：
56、取三七皂苷r1对照品、人参皂苷rg1对照品、人参皂苷re对照品、人参皂苷rb1对照品和人参皂苷rd对照品，精密称量，加甲醇配制成混合溶液，作为对照品溶液；
57、分别精密量取10～20μl的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪中，进行测定；对照品溶液和供试品溶液各自的进样量优选为10μl；
58、优选地，所述对照品溶液中：
59、三七皂苷r1的浓度为0.04mg/ml～0.12mg/ml，优选为0.06mg/ml；
60、人参皂苷rg1的浓度为0.1mg/ml～0.4mg/ml，优选为0.2mg/ml；
61、人参皂苷re的浓度为0.025mg/ml～0.07mg/ml，优选为0.035mg/ml；
62、人参皂苷rb1的浓度为0.09mg/ml～0.4mg/ml，优选0.18mg/ml；
63、人参皂苷rd的浓度为0.015mg/ml～0.05mg/ml，优选为0.024mg/ml。
64、在上述方案中，所述色谱柱的理论塔板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于8000。
65、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
66、1、本发明利用c18固相萃取小柱提取待测样品中的三七总皂苷，在上样之后先采用甲醇-氨水溶液淋洗，可以极大程度地去除目标成分三七总皂苷之外的干扰成分，得到干扰成分较少，或基本无干扰成分的供试品溶液，有利于改善采用所述供试品溶液进行后续检测的检测结果。
67、2、本发明采用高效液相色谱法进行含量测定，并优化了梯度洗脱的程序，尤其是延长了初始等梯度阶段的时长，令人参皂苷rg1和re的出峰保持在等梯度阶段，可改善两者在色谱图中的分离度，进而提高对这两个组分的定量准确性。
68、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
1.一种三七总皂苷的提取方法，其特征在于，包括：将待测样品溶解后上样至c18固相萃取小柱，然后采用甲醇-氨水溶液淋洗，弃去淋洗液；之后用水冲洗至中性，再加甲醇洗脱，收集洗脱液，即得含有三七总皂苷的供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的三七总皂苷的提取方法，其特征在于，所述的甲醇-氨水溶液中，甲醇的体积浓度为30％～36％，优选为36％。
3.根据权利要求1或2所述的三七总皂苷的提取方法，其特征在于，采用体积浓度为0.1％～2％的氨水溶液与甲醇混合，得到所述的甲醇-氨水溶液；
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的三七总皂苷的提取方法，其特征在于，采用10～30ml的甲醇-氨水溶液进行淋洗，优选采用15ml的甲醇-氨水溶液进行淋洗。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的三七总皂苷的提取方法，其特征在于，所述待测样品为三七提取物；精密称量所述三七提取物，加水后进行超声处理10～60min，然后进行离心处理，取离心液至c18固相萃取小柱，上样；优选地，配制含所述三七提取物为6～25mg/ml的溶液进行超声处理；
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的三七总皂苷的提取方法，其特征在于，上样之前对所述c18固相萃取小柱进行预处理，包括：
7.一种三七总皂苷的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6中任意一项所述的三七总皂苷的提取方法制备含有三七总皂苷的供试品溶液，然后利用所述供试品溶液进行鉴别和/或含量测定。
8.根据权利要求7所述的三七总皂苷的检测方法，其特征在于，进行鉴别包括：
9.根据权利要求7或8所述的三七总皂苷的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行含量测定，色谱条件包括：
10.根据权利要求9所述的三七总皂苷的检测方法，其特征在于，进行含量测定具体包括：
