本发明涉及生物工程，尤其是一种循环发酵生产l-苏氨酸的方法。
背景技术：
1、l-苏氨酸是猪饲料中继 l-赖氨酸之后的第二限制氨基酸，是家禽饲料中继 l-甲硫氨酸和l-赖氨酸之后的第三限制性氨基酸，可以改善机体的免疫功能与脂肪代谢，还可以促进生长、改善肉质、促进小肠黏液蛋白分泌、维持肠道健康等，具有重要的生理功能。除此之外，l-苏氨酸也被广泛应用于食品、医药和化妆品等很多领域。
2、目前工业上主要通过大肠杆菌（escherichia coli）发酵法生产l-苏氨酸。虽然工业发酵中所使用的大肠杆菌产l-苏氨酸的水平很高，但与理论糖酸转化率（81%）还有一定的差距，因此探究如何进一步提高大肠杆菌生产l-苏氨酸的能力，提高其糖酸转化率具有重要意义。
3、大肠杆菌作为l-苏氨酸生产菌，在发酵培养过程中容易生成乙酸、谷氨酸等代谢副产物，副产物的积累不仅造成碳源的浪费，且在一定程度上还严重抑制了菌体生长及l-苏氨酸的合成。其中，乙酸的抑制效果最为明显。当乙酸积累到一定浓度时，不仅对细胞代谢造成不利影响，同时还严重影响外源基因的表达，从而大大降低了l-苏氨酸的合成。基于此，探究合适的发酵培养基配方且对发酵工艺优化是提升大肠杆菌工程菌发酵能力的有效方法之一。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种循环发酵生产l-苏氨酸的方法。
2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
3、一种循环发酵生产l-苏氨酸的方法，采用大肠杆菌工程菌a.bu14经微生物发酵法生产l-苏氨酸，具体步骤如下：
4、（1）将大肠杆菌工程菌a.bu14传两代斜面活化培养；
5、（2）将活化后的菌株接种到种子罐进行种子培养，得到种子液；
6、（3）种子培养过程中待生物量od600为15-25时，将种子液接种到发酵罐，基于发酵罐中l-苏氨酸的产量进行循环发酵控制，得到l-苏氨酸。
7、上述大肠杆菌工程菌a.bu14为zl202410552098.5中的大肠杆菌工程菌a.bu14。
8、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，所述步骤（1）中活化培养的具体方法为：取大肠杆菌工程菌a.bu14划线接种于活化斜面，培养12h后转接至二代斜面中继续培养12h；采用的活化斜面培养基具体成分为葡萄糖1 g/l、蛋白胨4 g/l、氯化钠1 g/l、酵母浸出粉5 g/l、kh2po42 g/l、mgso4·7h2o 0.5 g/l、琼脂粉25 g/l、其余为水，ph=6.8-7.0，活化培养温度为32-37℃。
9、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，所述步骤（2）中种子培养的具体方法为：将活化好的菌株移至5l种子培养基中进行培养，ph维持在6.8-7.0，温度恒定在37℃，溶氧在30%-50%；采用的种子培养基具体成分为葡萄糖25 g/l、酵母粉5 g/l、蛋白胨4 g/l、柠檬酸2 g/l、(nh4)2so43 g/l、mgso4·7h2o 0.8 g/l、kh2po42 g/l、feso4·7h2o 20 mg/l、mnso410 mg/l、vb1、vb3、vb5、vb12各2 mg/l，vh 1 mg/l，其余为水。
10、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，所述步骤（3）中发酵培养的具体方法为：待种子菌体量（od600）达到15-25，将种子液接种到30l发酵罐中进行发酵培养；采用的发酵培养基具体成分为酵母粉4g/l、蛋白胨3g/l、玉米浆20ml/l、硫酸铵3g/l、蛋氨酸0.1g/l、kh2po4·3h2o 4g/l、谷氨酸2g/l、mgso4·7h2o 1.5g/l、feso4·7h2o 20mg/l、mnso410mg/l、vb1、vb3、vb5各2mg/l，其余为水。
11、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，所述步骤（3）中发酵培养的条件为：温度为37℃，ph为6.8-7.0，ph通过蠕动泵流加氨水进行维持，溶氧在30%-50%，罐压为0.03-0.05mpa，通风量为0.3-0.5vvm；罐内葡萄糖浓度为0-0.5 g/l（通过流加80%葡萄糖溶液进行维持，过程中每2 h取样1-3 ml发酵液进行测样）。
12、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，所述步骤（3）中循环发酵的具体步骤为：
13、1）首先将30l发酵罐与陶瓷膜进行偶联，然后在30l发酵罐内正常发酵生产l-苏氨酸，待l-苏氨酸产量≥90g/l时，打开阀门开始流出发酵液（同时补料等体积的葡萄糖溶液），透过陶瓷膜进行分离，上清液直接进行提取回收l-苏氨酸，浓缩液则回流到发酵罐中；
14、2）待发酵液中l-苏氨酸产量降至≤70g/l时，关闭阀门，使发酵罐继续进行正常发酵至90g/l时再次流出发酵液，如此往复循环发酵，使得发酵液中l-苏氨酸产量维持在70-90g/l；
15、3）共发酵50h，l-苏氨酸产量呈现出脉冲式曲线变化。
16、上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，偶联应用溶氧反馈补料策略和细胞循环发酵策略，一方面根据溶氧高低调控补糖速率，从而解除高浓度葡萄糖造成的底物抑制作用；另一方面随着细胞循环过程中清液的不断外排，降低反应体系中l-苏氨酸、乙酸及谷氨酸的浓度，解除产物和副产物的抑制作用。
17、所述溶氧反馈补料策略是指溶氧水平的高低与补料速率的大小成反比，以溶氧电极检测的溶氧数值高低为信号，通过调整补糖速率控制30-50%溶氧水平，将葡萄糖浓度及比生长速率控制在导致乙酸积累的临界值以下，从而减少乙酸分泌。发酵过程中l-苏氨酸产量达到一定值（≥90g/l时）开启循环发酵，降至一定值（≤70g/l时）停止循环发酵。
18、优选的，上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，在发酵过程中循环发酵时长为16-20h、20-24h或24-28h。
19、有益效果：
20、上述循环发酵生产l-苏氨酸的方法，通过将溶氧反馈补料策略和细胞循环发酵策略偶联应用，一方面可以根据溶氧高低调控补糖速率，从而解除高浓度葡萄糖造成的底物抑制作用；另一方面在细胞循环发酵过程中随着上清液不断外排，不仅减少了反应体系中产物l-苏氨酸和副产物乙酸、谷氨酸等的积累，可以适当解除产物和副产物的抑制作用；同时在循环发酵过程中，细胞得到充分利用，细胞的活性较高，提高了发酵罐中的细胞密度和生产效率；此外，所述方法实现了清液的连续分离外排，为后续提取工序节省了时间和分离设备的投入，直接降低了苏氨酸的生产成本，可以有效提升国产苏氨酸的市场竞争力。
1.一种循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：采用大肠杆菌工程菌a.bu14经微生物发酵法生产l-苏氨酸，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（1）中活化培养的具体方法为：取大肠杆菌工程菌a.bu14划线接种于活化斜面，培养12h后转接至二代斜面中继续培养12h；采用的活化斜面培养基具体成分为葡萄糖1 g/l、蛋白胨4 g/l、氯化钠1 g/l、酵母浸出粉5 g/l、kh2po4 2 g/l、mgso4·7h2o 0.5 g/l、琼脂粉25 g/l、其余为水，ph=6.8-7.0，活化培养温度为32-37℃。
3.根据权利要求1所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（2）中种子培养的具体方法为：将活化好的菌株移至5l种子培养基中进行培养，ph维持在6.8-7.0，温度恒定在37℃，溶氧在30%-50%；采用的种子培养基具体成分为葡萄糖25 g/l、酵母粉5 g/l、蛋白胨4 g/l、柠檬酸2 g/l、(nh4)2so4 3 g/l、mgso4·7h2o 0.8 g/l、kh2po4 2 g/l、feso4·7h2o 20 mg/l、mnso4 10 mg/l、vb1、vb3、vb5、vb12各2 mg/l，vh 1 mg/l，其余为水。
4.根据权利要求1所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵培养的具体方法为：待种子菌体量（od600）达到15-25，将种子液接种到30l发酵罐中进行发酵培养；采用的发酵培养基具体成分为酵母粉4g/l、蛋白胨3g/l、玉米浆20ml/l、硫酸铵3g/l、蛋氨酸0.1g/l、kh2po4·3h2o 4g/l、谷氨酸2g/l、mgso4·7h2o 1.5g/l、feso4·7h2o20mg/l、mnso4 10mg/l、vb1、vb3、vb5各2mg/l，其余为水。
5.根据权利要求1所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵培养的条件为：温度为37℃，ph为6.8-7.0，ph通过蠕动泵流加氨水进行维持，溶氧在30%-50%，罐压为0.03-0.05mpa，通风量为0.3-0.5vvm；罐内葡萄糖浓度为0-0.5g/l。
6.根据权利要求1所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（3）中循环发酵的具体步骤为：
7.根据权利要求1或6所述的循环发酵生产l-苏氨酸的方法，其特征在于：在发酵过程中循环发酵时长为16-20h、20-24h或24-28h。
