本发明涉及分子生物学，特别涉及一种egfr l858r突变位基因检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、靶向治疗是肺癌精准诊疗的主要方式，其中靶向药表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（egfr-tkis）应用最广。针对该靶向药敏感及耐药基因突变位点进行高效诊断，科学使用该药物已成为肺癌患者靶向治疗的首选。目前临床检测egfr基因突变的方法主要是arms-pcr和二代测序技术，但这两种技术均不能满足早期、精准、低成本检测的需求。
2、arms-pcr法在技术上存在非特异性扩增、假阳性问题；二代测序技术虽然敏感性较高，但检测流程复杂，周期较长，对设备、人员、场地均有较高需求，同时由于价格较高，应用受到较大限制。因此，研发新的检测技术，克服非特异性扩增、假阳性问题，在降低检测成本的同时提高检测技术的可操作性及普适性，是目前egfr液态活检基因检测试剂盒研发的热点和难点。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种egfr l858r突变位基因检测试剂盒及其应用，其针对现有技术的不足，借助恒温扩增技术与一步链置换探针偶联，通过链置换探针修饰荧光基团实现信号输出，将野生型基因序列和突变型基因序列有效区分。建立的新方法用于nsclc患者的早期筛查和指导靶向药物使用。
2、本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
3、一种egfr l858r突变位基因检测试剂盒，所述试剂盒包括lamp引物组和链置换探针，其中：
4、lamp引物组包括：一对外引物f3/b3、一对内引物fip/bip、一个环引物lp，其核苷酸序列如下：
5、外引物f3：5’-gcagccaggaacgtactg-3’（seq id no.1）；
6、外引物b3：5’-atcctcccctgcatgtgt-3’ （seq id no.2）；
7、内引物fip：5’-ttccgcacccagcagtttgggtgaaaacaccgcagcatg-3’ （seq idno.3）；
8、内引物bip：5’-ggaggcaaagtaaggaggtggcacagctagtgggaaggca-3’ （seq idno.4）；
9、环引物lp：5’-tttaggtcagccagcattttcc-3’ （seq id no.5）；
10、链置换探针包括f链和q链，核苷酸序列如下：
11、f链：5’-gcccgcccaaaatctgtgatcttgacatgccga-3’ （seq id no.6），其核苷酸序列的3’端采用荧光基团修饰；
12、q链：5’ -tcggcatgtcaagatcacagattttg-3’（seq id no.7），其核苷酸序列的5’端采用淬灭集团修饰、3’端修饰反向dt的核酸序列。
13、优选地，上述技术方案中，所述f链3’端的荧光基团为6-fam；所述q链5’端的淬灭集团为bhq1。
14、优选地，上述技术方案中，lamp引物组的f3、b3、fip、bip、lp的质量比为1:1:4:4:2。
15、优选地，上述技术方案中，f链和q链的摩尔比为1:3。
16、优选地，上述技术方案中，所述试剂盒具体为：每25 μl反应体系中包含：2.0 μl外引物和内引物组成的引物预混液、2.0 μl的lp引物、2.0 μl dntps、0.5 μl的mg2+、1.125 μl链置换探针、5.0 μl甜菜碱、2.5 μl等温扩增缓冲液、1.0 μl bst 2.0 dna聚合酶、1 μlegfr基因模板7.875 μl去离子水。
17、优选地，上述技术方案中，链置换探针的f链浓度为1 μm，dntps的浓度为10 mm，mg2+的浓度为100 mm，甜菜碱的浓度为5 m，等温扩增缓冲液的浓度为10×，bst 2.0 dna聚合酶的浓度为8 u，egfr基因模板浓度为2×106 拷贝/μl。dntps包括datp、dctp、dgtp、dttp，四者质量配比为1：1：1：1。引物预混液包括5 μm外引物f3、5 μm外引物b3、20 μm内引物fip和20 μm内引物bip。等温扩增缓冲液由0.2 m tris、0.1 m (nh4)2so4、0 .5 m kcl、0.02 m mgso4和0.4g tween-20组成。
18、一种egfr l858r突变位基因检测试剂盒在非疾病目的非小细胞肺癌早期筛查和/或egfr-tkis靶向药物制备中的应用。
19、一种非疾病目的检测egfr l858r突变位基因的方法，所述方法采用恒温扩增技术，具体包括以下步骤：
20、（1）准备待测dna模板样本；
21、（2） 配制反应体系，反应体系中包含引物预混液、链置换探针、dntps、甜菜碱、等温扩增缓冲液、mg2+和bst 2.0 dna聚合酶；
22、（3）将待测样本加入反应体系中，在62℃下进行恒温扩增反应，时间维持60min；
23、（4）通过监测荧光信号的变化来判定egfr l858r突变位基因的存在。
24、优选地，上述技术方案中，步骤（2）中，扩增体系中，链置换探针的f链浓度为1 μm，dntps的浓度为10 mm，mg2+的浓度为100 mm，甜菜碱的浓度为5 m，等温扩增缓冲液的浓度为10×，bst 2.0 dna聚合酶的浓度为8 u、待测dna样本浓度为5 ng/μl。
25、本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
26、本申请基于自主研发的精准分子诊断技术，拟借助改良的“环介导等温扩增-核酸分子线路”技术，利用新型引物设计法来减少非特异扩增、引入空白链段或错配修复来调整多重探针动力学、易程序化的逻辑线路来实现智能分析，获得兼具灵敏、快速、便携的egfr-tkis系列突变基因多重及智能检测新原理；结合临床样品分析，开发低成本、高效率、高精准的肺癌egfr液体活检基因检测试剂盒。
1.一种egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括lamp引物组和链置换探针，其中：
2.根据权利要求1所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，所述f链3’端的荧光基团为6-fam；所述q链5’端的淬灭集团为bhq1。
3.根据权利要求1所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，lamp引物组的f3、b3、fip、bip、lp的质量比为1:1:4:4:2。
4.根据权利要求1所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，f链和q链的摩尔比为1:3。
5.根据权利要求1所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具体为：每25 μl反应体系中包含：2.0 μl外引物和内引物组成的引物预混液、2.0 μl的lp引物、2.0 μl dntps、0.5 μl的mg2+、1.125 μl链置换探针、5.0 μl甜菜碱、2.5 μl等温扩增缓冲液、1.0 μl bst 2.0 dna聚合酶、1 μl egfr基因模板、去离子水。
6.根据权利要求5所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒，其特征在于，链置换探针的f链浓度为1 μm，dntps的浓度为10 mm，mg2+的浓度为100 mm，甜菜碱的浓度为5 m，等温扩增缓冲液的浓度为10×，bst 2.0 dna聚合酶的浓度为8 u，egfr基因模板浓度为2×106 拷贝/μl；dntps包括datp、dctp、dgtp、dttp，四者质量配比为1：1：1：1；引物预混液包括5 μm外引物f3、5 μm外引物b3、20 μm内引物fip和20 μm内引物bip；等温扩增缓冲液由0.2 mtris、0.1 m (nh4)2so4、0.5 m kcl、0.02 m mgso4和0.4 g tween-20组成。
7.根据权利要求1-6任一项所述的egfr l858r突变位基因检测试剂盒在非疾病目的非小细胞肺癌早期筛查和/或egfr-tkis靶向药物制备中的应用。
8.一种非疾病目的检测egfr l858r突变位基因的方法，其特征在于，所述方法采用恒温扩增技术，具体包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，扩增体系中，引物预混液包括5μm外引物f3、5 μm外引物b3、20 μm内引物fip和20 μm内引物bip，链置换探针的f链浓度为1μm，dntps的浓度为10 mm，mg2+的浓度为100 mm，甜菜碱的浓度为5 m，等温扩增缓冲液的浓度为10×，bst 2.0 dna聚合酶的浓度为8 u、待测dna样本浓度为5 ng/μl。
