本发明属于生物制药领域，具体涉及一种负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体、制备方法及应用。
背景技术：
1、急性肝衰竭是指由于药物中毒、肝脏缺血、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多种原因造成的大量免疫细胞浸润肝脏，产生炎症细胞因子，肝实质细胞大量急性坏死和肝功能损伤引起的以黄疸、凝血功能障碍以及肝性脑病等多器官功能障碍的一组临床综合征。由于氧化应激，alf患者体内线粒体和内质网功能受损，可导致肝细胞死亡，释放炎症介质，引起炎症反应和细胞凋亡，进一步导致急性肝衰竭的发生。因此，抗炎和抗氧化在alf的治疗中极为关键。alf患者在临床上大多都是对症支持治疗，但一些常规药物在治疗alf时由于溶解度差、非特异性器官毒性和血液循环稳定性差在临床治疗中受到了限制，除此之外alf可通过原位肝移植进行治疗，然而，其临床应用受到肝供体稀缺、成本高、器官移植排斥等限制。因此，迫切需要找到一种新型有效安全的治疗方法为alf的治疗提供一种新的途径。
2、树突状细胞(dendritic cell, dc)作为先天性免疫和后天性免疫系统之间的桥梁，是一类独特的免疫细胞。dc起源于造血干细胞，是机体内重要的抗原提呈细胞，可以聚集到感染部位或浸润病理组织，寻找可用于激活效应细胞的抗原。dc对于启动细胞免疫和体液免疫反应以及保护机体避免感染和清除肿瘤细胞至关重要。dc还可以利用特殊的表面受体如内吞受体或c型凝集素受体来吸收抗原。此外，dc装备了一系列的细胞外和细胞内模式识别受体感知不同的危险信号。在感受到危险信号后，dc被激活，上调共刺激分子，产生各种细胞因子和趋化因子，吸收抗原并加工，然后迁移到淋巴结，在淋巴结处向cd 8+t细胞和cd4+t细胞提呈抗原。
3、内毒素耐受是指生物体或细胞再预先暴露于低剂量的 lps 后对致死剂量的脂多糖的反应减弱甚至无反应。在内毒素耐受的状态下，机体能够耐受致死剂量的内毒素和细胞因子的释放以及炎症反应引起的细胞或组织的再灌注损伤。内毒素耐受的主要特征是炎症介质如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)的下调和抗炎细胞因子如il-10和转化生长因子(tgf-β)的上调，细胞表型从促炎反应转变为抗炎反应。因此，内毒素耐受常被认为是宿主对机体内过度炎症反应的一种自我保护机制。
4、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是指由生物体内细胞产生和分泌的膜包裹的囊泡，根据evs的生物发生和分泌方式的不同，可将其分成凋亡小体(apoptoticbodies)，微囊泡(microvesicles)和外泌体(exosomes, exo)。细胞外囊泡一旦释放到细胞外，可以到达靶细胞进行细胞间的通讯。大量研究表明evs可以调节免疫功能和减轻组织损伤。但由于细胞外囊泡的产量及低获取过程繁琐，一直是其在临床实践中广泛应用的障碍。外泌体模拟物(em)作为外泌体的替代产物，解决了外泌体产量低的问题，并保持了外泌体的优良性能。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体、制备方法及应用。
2、本发明的第一方面，提供一种负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体，其包括内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体和铱纳米酶颗粒，铱纳米酶颗粒包埋于所述仿生外泌体内。
3、本发明的第二方面，提供如上所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4、（1）制备内毒素耐受树突状细胞；
5、（2）通过乙醇热还原法制备铱纳米酶颗粒；
6、（3）将步骤（1）制备的内毒素耐受树突状细胞用步骤（2）制备的铱纳米酶颗粒配置的分散液重悬，使用脂质体挤出器将重悬后的液体通过1μm聚碳酸酯滤膜，挤出获得的样品通过20000 g 离心30 min，去掉上清，收集沉淀，得到负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体。
7、优选的，步骤（1）包括以下步骤：
8、将树突状细胞加入含有gm-csf 和 il-4 细胞因子的rpmi-1640 完全培养基，接种于孔板中，在37℃恒温培养箱中进行培养；
9、培养到第4天时，将孔板中的培养上清吸去，再次加入含有gm-csf和il-4细胞因子的rpmi-1640完全培养基；
10、在培养到第5天时加入100 ng/ml lps 进行刺激48 h，再在培养到第 7 天时吸去孔板中的培养上清，加入新鲜的含有gm-csf和il-4细胞因子的rpmi-1640完全培养基，并加入1μg/ml lps刺激24h从而获得内毒素耐受树突状细胞。
11、优选的，所述树突状细胞为小鼠骨髓来源的树突状细胞。
12、优选的，步骤（2）包括以下步骤：
13、将ircl3·3h2o溶解在纯水中，在超声仪中超声处理3h以上，得到透明的淡黄色溶液；
14、然后，将pvp溶于乙醇溶液中混匀，最后，在磁性搅拌下，将ircl3·3h2o 水溶液缓慢滴入pvp-乙醇溶液中，将混合物在室温下搅拌过夜；
15、隔天在100℃下冷凝回流6-8h，得到黑色溶液，再通过旋转蒸发仪去除多余的溶剂，得到黑色的产品，利用真空冷冻干燥机干燥得到铱纳米酶颗粒。
16、优选的，步骤（3）包括以下步骤：以2×106个细胞为一个单位，利用1ml分散液重悬，分散液中铱纳米酶颗粒的量为2 mg/ml。
17、本发明的第三方面，提供如上所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体制备治疗急性肝衰竭的药物的应用。
18、本发明的第四方面，提供一种治疗急性肝衰竭的药物，其包含如上所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体。
19、优选的，所述药物为注射制剂。
20、本发明采用有效的挤压方法从etdc中获得外泌体模拟物ems，与etdc分泌的外泌体相比，em产率大大提高，并且在保留了外泌体的生物活性分子基础上，其特异性标记物cd63呈阳性的囊泡比例显著增加。通过一锅法制备了聚乙烯吡咯烷酮(pvp)稳定的铱纳米粒子(ir nps-pvp)。ir nps-pvp具有良好的生物相容性和分散性，合成过程简单方便，产率很高，再利用挤压法将ir nps-pvp与etdc经过聚碳酸酯膜同时挤出，构建etdc-em/ir nps-pvp复合体。
21、ir nps-pvp具有多酶模拟活性，可以有效消除ros。在raw264.7细胞的抗炎实验中，etdc-em能够有效减轻炎症，在细胞内发挥了良好的作用。同时，作为 ir nps-pvp 的载体，etdc-em不仅能够在体内发挥良好的抗炎作用，并且能够延长 ir nps-pvp 在体内的循环时间，延缓 ir nps-pvp 的抗氧化作用。因此，本发明的etdc-em/ir nps-pvp复合体同时能够起到抗炎以及抗氧化的作用，并且能起到协同效果，使治疗效果更有效。
22、具体的，通过尾静脉注射etdc-em/ir nps-pvp，肉眼观察发现经etdc-em/ir nps-pvp治疗后的alf小鼠肝脏组织充血明显减轻，对肝脏组织进行苏木精和伊红(he)染色，证实了etdc-em/ir nps-pvp减轻了alf小鼠的肝脏水肿变性、组织损伤、炎症细胞浸润的症状。经etdc-em/ir nps-pvp治疗后的小鼠体内炎症因子包括白介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转氨酶浓度显著下降。此外小鼠肝脏组织线粒体是ros产生和清除的重要细胞器，线粒体功能障碍在氧化应激疾病中起着至关重要的作用，内质网的氧化应激也会诱导ros释放。总之，etdc-em/ir nps-pvp表现出优异的抗炎抗氧化作用，并在缓解alf方面具有临床转化潜力。
23、综上所述，本发明提供了一种内毒素耐受树突状细胞来源的外泌体模拟物(etdc-em)，并且将ir nps-pvp装入etdc-em中，体外实验证明etdc-em具有良好的抗炎作用，irnps-pvp具有良好的抗氧化作用，而在alf模型小鼠体内验证etdc-em/ir nps-pvp仍然具有良好的抗炎和抗氧化作用。
1.一种负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体，其特征在于：其包括内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体和铱纳米酶颗粒，铱纳米酶颗粒包埋于所述仿生外泌体内。
2.如权利要求1所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，其特征在于：步骤（1）包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，其特征在于：所述树突状细胞为小鼠骨髓来源的树突状细胞。
5.根据权利要求2所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，其特征在于：步骤（2）包括以下步骤：
6.根据权利要求2所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体的制备方法，其特征在于：步骤（3）包括以下步骤：以2×106个细胞为一个单位，利用1ml分散液重悬，分散液中铱纳米酶颗粒的量为2 mg/ml。
7.如权利要求1所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体制备治疗急性肝衰竭的药物的应用。
8.一种治疗急性肝衰竭的药物，其特征在于：其包含如权利要求1所述的负载铱纳米酶的内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体。
9.根据权利要求8所述的治疗急性肝衰竭的药物，其特征在于：所述药物为注射制剂。
