本发明涉及生物，具体涉及一种kcnb1离子通道稳转细胞株构建方法及其在塑料可迁移物质与降解产物的毒性筛查中的应用。
背景技术：
1、离子通道是一类与皮肤致敏、疼痛、神经毒性等多种毒性相关的重要机制。电压门控钾离子（k+）通道是一类数量庞大、种类众多的离子通道家族，其在调节神经元兴奋性中扮演着基础性作用。异常的神经兴奋可能会引起诸多不良结局如阿尔茨海默病等。
2、中国专利cn116144705a中公开了一种高效制备电压依赖性钙离子通道细胞模型的方法，该专利中公开了一组共表达人cav1.2钙离子通道蛋白的载体，包括载体1和载体2，所述人cav1.2钙离子通道蛋白包括α1、α2/δ1和β三个亚基；所述载体1含有teton启动子，α2/δ1和β亚基的表达序列位于teton启动子下游；同时载体1具备rtta表达元件，由cmv启动子驱动表达，载体1还含有抗性基因1；所述载体2含有teton启动子，egfp和α1亚基的表达序列位于teton启动子下游；载体2还含有抗性基因2；所述α2/δ1和β亚基的表达序列之间通过t2a肽的表达序列连接；所述egfp和α1亚基的表达序列之间通过p2a肽的表达序列连接。还公开了以此为基础高效制备电压依赖性钙离子通道细胞模型的方法；通过多西环霉素诱导，该发明之细胞系具有稳定表达、且具有功能性的人类cav1.2钙离子通道的特性。该发明提供人类心肌细胞之外的替代细胞系—cav1.2钙离子通道表达hek293t细胞系，作为有效且经济的药物体外心安全性评价。但其仅针对cav1.2钙离子通道。
3、目前，对离子通道的毒性测试尚无标准的动物实验方法，并且离子通道的种属特异性使得动物来源的实验体系无法解决物种外推的问题。生物分解塑料中存在的降解产物和中间体可能具有扰动离子通道的作用，但其种类繁多、含量极低，采用正常的细胞系因离子通道表达量少敏感性低的原因，达不到低剂量识别和快速筛查的目的。由于系统完整的离子通道稳定表达的人源细胞系的缺乏，限制了相关毒性效应测试系统的建立。
4、因此，本发明通过构建kcnb1离子通道的稳定表达细胞模型，针对生物分解塑料中可迁移物质与降解产物，进行兴奋性或抑制性神经毒性测试，从而建立基于离子通道相关毒性的检测和筛查技术。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种kcnb1离子通道稳转细胞株的构建方法。
2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
3、一方面，本发明提供了一种kcnb1离子通道稳转细胞株的构建方法，包括质粒载体的构建，为以cdna为模板通过pcr技术克隆kcnb1基因序列，通过双酶切技术连接到质粒pcslenti-ef1-egfp-p2a-puro-cmv-mcs-3xflag-wpre上，使用连接酶连接，得到pcslenti-ef1-egfp-p2a-puro-cmv-kcnb1-3xflag-wpre慢病毒载体。
4、具体地，所述的kcnb1基因序列为ncbi referencesequence：nm_004975.4。
5、具体地，以cdna为模板通过pcr技术克隆kcnb1基因序列后得到前端带有xbai酶切位点，后端带有ecori酶切位点的片段。
6、进一步地，所述的连接酶为t4 dna连接酶。
7、具体地，所述的构建方法包括以下步骤：
8、（1）将细胞置于培养基中培养；
9、（2）质粒载体的构建；
10、（3）将dna转染试剂复合体加入到步骤（1）培养后的细胞中进行转染，转染后离心，加入缓冲液溶解沉淀，得到病毒；
11、（4）消化细胞后进行接种，加入病毒进行感染；
12、（5）将细胞配成（1-10）×105cells/ml细胞悬液，孵育12-20h后感染病毒，加入polybrene，得kcnb1离子通道稳转细胞株。
13、具体地，步骤（1）中所述的细胞包括hek293细胞、sh-sy5y细胞、hacat细胞。
14、进一步地，步骤（1）中所述的细胞为hek293细胞。
15、具体地，步骤（1）的培养基的组分包括胎牛血清、l-谷氨酰胺和双抗。
16、进一步地，所述的胎牛血清的浓度为5-15%，l-谷氨酰胺的浓度为1-5mm；
17、再进一步地，所述的胎牛血清的浓度为10%，l-谷氨酰胺的浓度为2mm。
18、进一步地，所述的双抗包括青霉素和链霉素，所述的青霉素的浓度为50-150u/ml，所述的链霉素的浓度为50-150μg/ml。
19、再进一步地，所述的青霉素的浓度为100u/ml，所述的链霉素的浓度为100μg/ml。
20、具体地，步骤（1）中培养的条件为37℃，5%co2。
21、具体地，步骤（3）转染时控制细胞转染时的密度为70-80%。
22、具体地，步骤（3）中dna转染试剂复合体包括转染试剂和质粒复合物。
23、进一步地，所述的质粒复合物包括骨架质粒和穿梭质粒；
24、再进一步地，所述的骨架质粒和穿梭质粒的质量比为1-2:1；优选地，所述的骨架质粒和穿梭质粒的质量比为1：1。
25、具体地，所述的骨架质粒为pcslenti-ef1-egfp-p2a-puro-cmv-mcs-3xflag-wpre，所述的穿梭质粒为pcmv-vsvg。
26、具体地，所述的质粒复合物为将病毒载体质粒溶于培养基中。
27、进一步地，所述的转染试剂的制备为将转染试剂溶于培养基中。
28、所述的培养基选自opti-mem培养基dmem培养基、rpmi1640培养基中的一种或多种；
29、进一步地，所述的培养基为opti-mem培养基。
30、具体地，所述的dna转染试剂复合体中转染试剂与质粒复合物的质量体积比为（30-40）μg：500μl。
31、进一步地，所述的dna转染试剂复合体中转染试剂与质粒复合物的质量体积比为32μg：500μl。
32、具体地，步骤（3）中转染48小时后进行第一次收毒；收毒后更换新鲜培养基；转染72小时后，第二次收毒。
33、具体地，步骤（3）中离心的次数为2次，第一次离心的转速为3500rpm，离心的时间为10min，离心的温度为常温。
34、进一步地，第一次离心后收集上清，进行第二次离心；第二次离心的转速为30000rpm，离心的时间为2h，离心的温度为4℃。
35、进一步地，步骤（3）中加入缓冲液的体积为100μl。
36、进一步地，所述的缓冲液为dpbs缓冲液。
37、具体地，步骤（4）中消化细胞使用的消化酶为胰酶。
38、具体地，步骤（4）中细胞的接种量为（1-10）×105；进一步地，细胞的接种量为1×105。
39、具体地，步骤（5）中polybrene的终浓度为（4-10）μg/ml；
40、进一步地，步骤（5）中polybrene的终浓度为5μg/ml。
41、具体地，步骤（5）中72h后，再加入终浓度为（1-3）μg/ml的polybrene。
42、进一步地，72h后，再加入终浓度为2μg/ml的polybrene。
43、又一方面，本发明提供了上述的构建方法构建得到的kcnb1离子通道稳转细胞株。
44、又一方面，本发明提供了上述的构建方法在生物分解塑料中可迁移物质与降解产物高通量兴奋性细胞毒性筛查中的应用。
45、具体地，所述的可迁移物质包括热稳定剂、扩链剂、有机磷酸酯类阻燃剂、抗紫外线吸收剂、抗氧化剂及其降解产物、邻苯二甲酸酯类物质、全氟化合物，所述的降解产物包括苯基三氯化锡、过氧化二叔丁基、二苯甲烷二异氰酸酯。
46、进一步地，所述的热稳定剂为有机锡类化合物。
47、进一步地，所述的扩链剂包括二甲硫基甲苯二胺、异氰酸酯类。
48、进一步地，所述的抗紫外线吸收剂包括苯并三唑。
49、进一步地，所述的抗氧化剂降解产物包括对叔丁基苯酚、过氧化二叔丁基。
50、再进一步地，所述的降解产物为有机锡类物质中的苯基三氯化锡。
51、本发明的有益效果为：
52、1、本发明构建的kcnb1离子通道稳转细胞株比常规细胞对污染物毒性更敏感；
53、2、构建的基因序列为膜受体片段，更能体现其离子通道活性；
54、3、构建的载体同时带有egfp标签及flag标签，有利于离子通道稳转细胞的观察及筛选；
55、4、该病毒可感染hek293等细胞，满足不同来源细胞的毒性筛查；
56、5、可以实现生物分解塑料中可迁移物质与降解产物高通量兴奋性细胞毒性的筛查。
1.一种kcnb1离子通道稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括质粒载体的构建，为以cdna为模板通过pcr技术克隆kcnb1基因序列，通过双酶切技术连接到质粒pcslenti-ef1-egfp-p2a-puro-cmv-mcs-3xflag-wpre上，使用连接酶连接，得到pcslenti-ef1-egfp-p2a-puro-cmv-kcnb1-3xflag-wpre慢病毒载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的kcnb1基因序列为ncbireferencesequence：nm_004975.4。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的连接酶为t4 dna连接酶。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述的细胞包括hek293细胞、sh-sy5y细胞、hacat细胞。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述的细胞为hek293细胞。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中dna转染试剂复合体包括转染试剂和质粒复合物；所述的质粒复合物包括骨架质粒和穿梭质粒；所述的骨架质粒和穿梭质粒的质量比为1-2:1。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的骨架质粒和穿梭质粒的质量比为1：1。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的质粒复合物为将病毒载体质粒溶于培养基中，所述的培养基选自opti-mem培养基、mrs培养基、m17培养基、pda培养基、lb培养基、tb培养基、sob培养基、dmem培养基、rpmi1640培养基中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的培养基为opti-mem培养基。
11.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中消化细胞使用的消化酶为胰酶。
12.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）中polybrene的终浓度为（4-10）μg/ml。
13.权利要求1-12任一项所述的构建方法构建得到的kcnb1离子通道稳转细胞株。
14.权利要求1-12任一项所述的构建方法在生物分解塑料中可迁移物质与降解产物高通量兴奋性细胞毒性筛查中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的可迁移物质包括热稳定剂、扩链剂、有机磷酸酯类阻燃剂、抗紫外线吸收剂、抗氧化剂及其降解产物、邻苯二甲酸酯类物质、全氟化合物，所述的降解产物包括苯基三氯化锡、过氧化二叔丁基、二苯甲烷二异氰酸酯。
