本发明属于生物医学，尤其涉及一种胆固醇分子印迹材料的制备及其应用。
背景技术：
1、外泌体(exosomes)是一种由脂质膜包裹的直径约为30-150nm是细胞外囊泡，其广泛存在于人体的各种体液中，如血液、尿液、脑脊液和唾液。研究表明，外泌体在细胞间的信号转导、抗原递呈、组织修复和肿瘤发生与耐药过程中发挥重要的作用。因含有丰富的生物信息(核酸、蛋白质、脂质及代谢物)，外泌体已成为液体活检材料中的一个重要组成部分。相较于传统体液活检材料如循环肿瘤细胞(ctcs)和无细胞核酸(cell free-dna)，外泌体具有以下几点优势：1)获取相对方便；2)具有稳定的膜结构；3)多层面反映出亲代细胞的生物学信息。这些特性使得外泌体在临床疾病的诊断方面展现了巨大的潜力。
2、在外泌体用于临床检测的过程中，能否有效检测到疾病的关键在于外泌体的提取效率和质量。目前外泌体的分离方法包括超速离心法、沉淀法、尺寸排阻色谱法等，但针对于体液活检，尤其是面对临床中大规模样本检测时，这些传统方法都存在各自的不足。近期的研究表明，使用纳米材料来富集和分离外泌体可能是一种有前景的方法，因为它消耗的样本量较少且富集过程简单快速，这为大规模临床样本中分离外泌体提供了新的可能性。鉴于当前外泌体分离技术存在的效率低下、合成复杂及成本较高的问题，亟需开发一种高通量且有效的外泌体富集分离方法。为此本发明提出一种胆固醇分子印迹材料的制备及其应用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种胆固醇分子印迹材料的制备及其应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种胆固醇分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤1、水/油反相微乳液的制备：将1.77mltritionx-100、1.6ml正己醇、6.5ml环己烷、480μl水和100μl氨水(nh3·h2o)加入100ml烧杯中，使用磁力搅拌器在25℃下以700rpm的速度搅拌烧杯内的混合物，直至溶液变得透明澄清，形成反相微乳液，继续磁力搅拌30min；
5、步骤2、分子印迹聚合物的合成：将4mg胆固醇加入制备好的微乳液中；混合750μl环己烷、100μl正硅酸乙酯(teos)和26μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，形成印迹溶液，将印迹溶液逐渐滴加到含有胆固醇的微乳液中，然后使用磁力搅拌器在25℃下以700rpm的速度搅拌24h；搅拌结束后，向微乳液中加入2ml乙醇使乳液破碎，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物先用去离子水洗涤一次，接着用无水甲醇与乙酸的混合溶液洗涤一次，再用甲醇洗涤两次，最后在70℃下干燥，得到胆固醇分子印迹材料，即cho-mip，备用。
6、进一步的，所述无水甲醇与乙酸的体积比为4:1。
7、一种根据上述所述的制备方法制得的cho-mip。
8、一种根据上述所述的cho-mip在富集分离外泌体中的应用。
9、进一步的，具体流程如下：
10、步骤1、样品预处理：将收集的液体活检样品在17000×g条件下离心20min；离心后，留上清去除底部沉淀物，备用；
11、步骤2、外泌体富集及及代谢物提取：在2ml ep管中称取4mg cho-mip，用500μlpbs洗涤两次，以10000rpm离心3min，留下沉淀物；向沉淀物中加入200μlpbs使其分散并形成浑浊溶液；将2ml新鲜尿液与浑浊溶液混合，在室温下置于旋转器上摇动试管30min，然后以10000rpm离心3min，留下沉淀物；用200μlpbs洗涤两次以除去残留尿液，然后以10000rpm离心3min，留下沉淀物；将沉淀物与1ml代谢物提取液混合均匀，先超声处理10min，再涡旋10min，最后将混合液反复置于液氮和37℃水浴锅中以破坏膜结构；在冰上使用0.22μm过滤器过滤上清液，过滤后的提取液用氮气吹干；用50μl 50％meoh水溶液重新溶解吹干后的样品，并在4℃下以14000×g离心15min，然后将上清液转移到液相瓶中，准备进行代谢物分析；
12、步骤3、代谢物质谱鉴定与分析：采用lc-ms对cho-mip富集得到的外泌体代谢物进行分析；样品首先通过色谱柱进行分离，随后进入质谱仪，在正离子模式下进行分析；使用masslynxv4.2以及ms-dial软件对得到的质谱数据进行处理，并使用rstudio软件对处理后的数据进行机器学习，以完成分析。
13、进一步的，所述代谢物提取液为预冷的50％meoh水溶液。
14、进一步的，所述质谱仪的参数设置包括：进样时间为12min，喷雾电压为1.50kv、毛细管温度为80℃、质核比扫描范围为50-1000da。
15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16、本发明运用反相微乳液结合胆固醇印迹模板，合成了分子印迹聚合物，实现了体液中外泌体的高通量、有效富集分离，极大地提升了分离效率并降低了成本，为体液活检技术中的外泌体应用开辟了新路径，尤其在人体尿液外泌体分离上展现出显著的临床应用潜力，预示着在生物医学研究及未来健康评估中的广泛前景。
1.一种胆固醇分子印迹材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无水甲醇与乙酸的体积比为4:1。
3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法制得的cho-mip。
4.一种根据权利要求3所述的cho-mip在富集分离外泌体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体流程如下：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述代谢物提取液为预冷的50％meoh水溶液。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述质谱仪的参数设置包括：进样时间为12min，喷雾电压为1.50kv、毛细管温度为80℃、质核比扫描范围为50-1000da。
