本发明涉及一种d-甘露糖2-差向异构酶在d-甘露糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
1、d-甘露糖是d-葡萄糖在c-2位的立体异构体，也是自然界中一些多糖和糖蛋白的成分。迄今为止，d-甘露糖因其对人类健康的诸多有益健康作用而备受关注，包括刺激胰岛素分泌、治疗或预防尿路感染、阻断定植和促进肠道益生菌生长。它在免疫刺激剂、抗肿瘤剂、维生素和d-甘露醇的合成中起着重要作用。此外，d-甘露糖已被用作添加剂，在家禽业中有效抑制沙门氏菌的肠道增殖。d-甘露糖在食品、制药和饲料工业中表现出优异的生理特性。
2、目前d-甘露糖的制备主要有植物提取、化学合成以及生物酶法3种途径，其中生物酶法因其反应条件温和、环境友好和成本低等优势，已成为制备d-甘露糖的研究趋势。目前的研究大部分集中在以d-果糖为底物制备d-甘露糖，通过d-甘露糖异构酶(mannoseisomerase miase,ec 5.3.1.7)生产d-甘露糖，但是该反应转化率低且以d-果糖为底物生产d-甘露糖成本较高。而与d-果糖底物相比，d-葡萄糖在来源与价格方面都占据独特的优势，这就需要我们去挖掘能以d-葡萄糖为底物制备d-甘露糖的新反应路径或酶资源。
3、2014年，park等人发现来源于caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖2-差向异构酶(cellobiose 2-epimerase，cease；ec 5.1.3.11)具备催化d-葡萄糖和d-甘露糖间可逆差向异构化的活性，其平衡转化率大约为15.67％。但是该反应是cease的副反应，反应体系中约有5％的d-果糖副产物积累，且转化率过低，不适合工业中的大体系制备。2019年，saburi等人报道了两种来自runella slithyiformis和dyadobacterfermentans的d-甘露糖2-差向异构酶(mease,ec 5.1.3.-)，分别命名为runse_4512和dfer_5652。与cease类似，mease也可以直接将d-葡萄糖转化为d-甘露糖。在50℃和ph 8.0下，以500g/l的d-葡萄糖为底物反应48小时后，使用runse_4512和dfer_5652在系统中分别产生122和114g/l的d-甘露糖，转化率分别为24.4％和22.8％。因此相比于纤维二糖2-差向异构酶，d-甘露糖2-差向异构酶在以d-葡糖为底物制备d-甘露糖中更具备优势。然而，目前为止文章或专利报道的d-甘露糖2-差向异构酶极少，仅报道的runse_4512和dfer_5652两种不同来源的酶转化率偏低不适合工业中的大规模应用，因此，需要挖掘或者鉴定具有高催化效率的酶资源。
技术实现思路
1、本发明提供了一种编码d-甘露糖2-差向异构酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2、在一种实施方式中，所述d-甘露糖2-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、本发明提供了一种载体，所述载体携带编码d-甘露糖2-差向异构酶的基因。
4、在一种实施方式中，所述载体的出发载体为表达载体pet-24a(+)。
5、在一种实施方式中，所述载体包括但不限于ppic9k、ppic3k、pet系列载体、duet系列、pgex系列。
6、本发明还提供了携带所述基因或者所述载体的微生物细胞。
7、在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌、真菌细胞。
8、在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。
9、本发明提供了一种重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如seq id no.2所示的d-甘露糖2-差向异构酶。
10、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)。
11、本发明提供了一种生产d-甘露糖的方法，所述方法是将seq id no.2所示d-甘露糖2-差向异构酶在以d-葡萄糖为底物的体系中反应。
12、在一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌发酵制备的d-甘露糖2-差向异构酶粗酶液或纯化后的纯酶用于催化反应。
13、在一种实施方式中，所述粗酶液是将所述重组菌的菌体细胞破壁后离心收集的含酶的上清液。
14、在一种实施方式中，所述方法是将所述重组菌发酵获得的发酵液经细胞破碎后用于催化反应。
15、在一种实施方式中，对反应后的反应液纯化，得到d-甘露糖。
16、在一种实施方式中，所述反应在水相介质中进行，所述水相介质包括但不限于水或缓冲液。
17、在一种实施方式中，所述反应在磷酸盐缓冲液中进行；所使用磷酸盐缓冲液的浓度为40～60mm，ph为6.0～7.5。
18、在一种实施方式中，所述反应在tris-hcl缓冲液中进行；所使用tris-hcl缓冲液的浓度为40～60mm，ph为7.0～8.5。
19、在一种实施方式中，所述反应在水中进行，并使用naoh调节ph为7.5～8.5。
20、在一种实施方式中，所述d-甘露糖2-差向异构酶的加酶量为0.2～2mg/ml，或0.25～1mg/ml，或0.5～1mg/ml。
21、在一种实施方式中，所述d-葡萄糖浓度为500～600g/l。
22、在一种实施方式中，所述方法是在30～45℃下反应至少24h，或24～48h。
23、本发明还保护所述基因，或所述表达载体在食品和化妆品领域制备d-甘露糖或含d-甘露糖的产品中的应用。
24、本发明还保护所述重组菌在食品和化妆品领域制备d-甘露糖或含d-甘露糖的产品中的应用。
25、有益效果：
26、(1)本发明筛选到bacteroidetes bacterium来源的d-甘露糖2-差向异构酶bbme。由化学法合成编码bbme的核苷酸序列，以质粒pet-24a(+)为表达载体，以e.coli bl21(de3)为表达宿主，实现了bbme基因在大肠杆菌中的表达。
27、(2)本发明提供了应用d-甘露糖2-差向异构酶bbme生产甘露糖的方法，并研究了酶适宜的反应条件，该酶在40℃，ph为8.0时具有较为理想的催化活性。
28、(3)本发明通过将构建的重组大肠杆菌进行高密度发酵，将对菌体破壁后的粗酶液直接用于转化生产d-甘露糖，可在500g/l葡萄糖的浓度条件下利用d-葡萄糖生成d-甘露糖，产量能达到141.05g/l，转化率可达28.21％，是迄今为止d-甘露糖2-差向异构酶法合成d-甘露糖的最高产量。该酶适合食品、医药等工业应用的需要，能用于d-甘露糖的工业化生产。
1.编码d-甘露糖2-差向异构酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.携带权利要求1所述基因的重组表达载体。
3.携带权利要求1所述基因，或含有权利要求2所述重组表达载体的微生物细胞。
4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达氨基酸序列如seq id no.2所示的d-甘露糖2-差向异构酶。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pet-24a(+)为表达载体，在e.coli bl21(de3)中表达seq id no.1所示的d-甘露糖2-差向异构酶基因。
6.一种制备d-甘露糖2-差向异构酶的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的重组大肠杆菌在培养基中培养，收集培养液中的d-甘露糖2-差向异构酶。
7.一种生产d-甘露糖的方法，其特征在于，将seq id no.2所示d-甘露糖2-差向异构酶在以d-葡萄糖为底物的反应体系中反应；所述d-甘露糖2-差向异构酶包括但不限于(a)～(e)的任一种：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应在缓冲液体系或纯水中进行；所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述d-甘露糖2-差向异构酶的加酶量为0.2～2mg/ml；所述d-葡萄糖浓度为500～600g/l。
10.权利要求3所述的微生物细胞，或权利要求4～5任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求6～9任一所述方法在食品或化妆品领域制备含d-甘露糖的产品方面的应用。
