本发明涉及生物，尤其涉及靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物及其筛选方法和应用。
背景技术：
1、柑橘黄龙病(huanglongbing，hlb)严重冲击着全球多个国家和地区的柑橘产业，影响着该行业的健康发展。截止到2021年，在我国发生的面积已经达到了14.7万hm2，涉及广东、福建、湖南等11个省约300个县，约有五千万株柑橘植株遭受了柑橘黄龙病的危害。鉴于当前国内外尚无根治黄龙病的特效方法，业界普遍依赖“三板斧”综合防控策略：强化木虱监测与防治、及时砍伐病树以减少病原扩散，以及推广无病毒苗木的培育。但这些措施均面临显著局限：化学药剂控制木虱易引发环境污染与抗药性问题；砍伐病树成本高企，果农经济负担沉重，需政府高额补贴支持；而无病毒苗木的生产则受限于优良品种资源的高病原感染率，脱毒技术复杂且影响苗木成活率。因此，探索高效、低毒、经济的抗黄龙病药物成为科研领域的迫切需求。然而，黄龙病病原——韧皮部杆菌(candidatusliberibacter)难以人工纯培养的特性，极大地增加了通过常规方法进行抗菌药物的筛选的难度。
2、肽聚糖(peptidoglycan)也称胞壁质，是细菌细胞壁的主要组成成分，在维持细胞形态、大小、渗透压稳定以及细胞存活方面发挥着重要作用。在肽聚糖生物合成的过程中，murc-f这一系列的氨基酸连接酶发挥着重要的作用，它们参与了第一阶段的催化五肽尾形成的过程。肽聚糖的生物合成是一个高度保守的过程，不同的细菌菌种具有特异性，其中mur系列连接酶功能十分重要。研究表明，很多重要的抗生素都能特异性靶向肽聚糖的生物合成过程，因此，可以将mur系列连接酶作为研究新型抗菌药物的潜在靶点。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提出了以韧皮部杆菌murd连接酶作为抗黄龙病化合物筛选的新靶点，并通过候选化合物与murd蛋白的互作分析，从而高效筛选出潜在murd抑制活性的化合物，显著增强了筛选过程的高度特异性与有效性。
2、为此，本发明构建了murd基因的重组表达系统，在宿主菌中表达并纯化murd蛋白，随后与候选化合物进行互作分析，筛选出能高效抑制murd的抗黄龙病候选药物。进一步，将筛选出的三种小分子化合物(nilofabicin、pa-824和afn-1252)在黄龙病阳性柑橘接穗上进行验证，采用高浓度短时间的处理方式，验证结果证实nilofabicin、pa-824和afn-1252有效提高了阳性接穗转阴率，同时保持了较高的萌芽率。本发明不仅加速了抗黄龙病药物的研发进程，还提高了筛选效率与准确性，为黄龙病的有效防治提供了强有力的技术支持。
3、本发明的技术方案是这样实现的：
4、第一方面，本发明提供了一种靶向韧皮部杆菌(candidatusliberibacter)murd的抗黄龙病化合物的筛选方法，包括如下步骤：
5、s1、将含目的基因片段的重组表达载体转化至宿主菌，得到重组表达菌株，所述目的基因片段包括编码氨基酸序列如seq id no.1所示的murd连接酶的dna序列；
6、s2、诱导重组表达菌株表达目的蛋白murd，分离、纯化目的蛋白，并采用sds-page凝胶电泳检测分析，然后收集纯化蛋白；
7、s3、测定候选化合物与纯化蛋白murd相互作用的能力，筛选出能够与纯化蛋白murd结合的化合物即为靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物。
8、在一些优选的实施例中，所述靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物的筛选方法，还包括步骤：
9、s4、将柑橘黄龙病阳性接穗随机分为实验组与ck组，实验组用所述步骤s3筛选所得的化合物处理；ck组以清水处理；在相同条件培养至接穗萌芽，然后采用qpcr，以新芽顶端分生组织的dna为模板进行病原检测；若实验组的黄龙病阴性率高于ck组，则验证结果表明，所筛选的化合物对黄龙病病原具有抑制作用。其中，在部分实施例中，
10、所述阳性接穗的长度6-8个节位/条，将待验证的所述步骤s3筛选所得的化合物配置为50-200μm浓度的溶液，将处理好的阳性接穗扦插于配制好的含有1/3泥碳，1/3蛭石，1/3土壤的培养基中；扦插容器为高9cm,长7.5cm,宽7.5cm的pc材料制备的培养盒；使用含有50-200μm待验证化合物的1/4ms培养液进行喷施处理，每3d喷施一次，一次喷施10ml；在26±1℃恒温、光照强度4000lx、光照与黑暗各12h交替的条件下进行培养。
11、在一些优选的实施例中，所述步骤s1具体还包括：
12、a1、以携带黄龙病的柑橘叶片中提取的基因组dna为模板，正反引物序列分别如seq id no.2-3所示，pcr扩增所述目的基因片段；
13、a2、分别用bamhi和xho i酶将pcr产物连接至线性化载体pet28a-sumo，再转化至e.coli dh5α感受态细胞，将转化后的dh5α细胞中的重组质粒提取后进行基因测序；将基因测序结果正确的质粒转化e.coli bl21感受态细胞，得到重组表达菌株。
14、在一些优选的实施例中，所述步骤s2具体还包括：
15、b1、用lb培养基培养所述重组表达菌株，再通过iptg诱导以表达出目的蛋白；
16、b2、所述分离目的蛋白包括，通过透析去除咪唑，通过ulp1蛋白酶酶切去除sumo标签；所述层析包括镍柱亲和层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析。
17、在一些优选的实施例中，所述步骤s3具体还包括：采用等温滴定量热法测定各候选化合物与纯化蛋白murd的结合常数ka。其中，在部分实施例中，候选化合物溶液浓度50-500μm，murd蛋白溶液浓度20-50μm；等温滴定量热法的参数设置包括：滴数10，每滴时间间隔120s，功率10μcal/s，搅拌器转速250r/min。
18、第二方面，本发明提供了通过上述任一种靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物的筛选方法，获得的靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物。进一步地，所述抗黄龙病化合物包括：nilofabicin、pa-824或afn-1252。
19、第三方面，本发明还提供了靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物在防治黄龙病中的应用，所述抗黄龙病化合物由上述任一种靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物的筛选方法筛选获得，和/或，所述抗黄龙病化合物包括nilofabicin、pa-824或afn-1252。
20、本发明的有益效果至少包括如下：
21、(1)本发明以韧皮部杆菌murd连接酶作为抗黄龙病化合物筛选的新靶点，并通过候选化合物与murd蛋白的互作分析，高效筛选出潜在murd抑制活性的化合物，本方面提供的筛选方法显著增强了筛选过程的高度特异性与有效性。同时，本发明能够迅速识别出具有潜在抗黄龙病活性的化合物，大幅缩短了从化合物库初筛到抗病活性验证的周期，为黄龙病的防控提供及时有效的解决方案。本发明的研究成果有助于揭示murd连接酶在黄龙病发生发展的关键作用，为防治黄龙病提供理论依据，以及为其他植物病害的研究提供了可借鉴的思路和方法。
22、(2)本发明所筛选出的小分子化合物nilofabicin、pa-824和afn-1252，具有抗黄龙病作用。例如脱毒率达41.6％的afn-1252小分子化合物在接穗处理中的显著潜力，预示着其能显著提升无病苗木的培育成功率。afn-1252等化合物对于茎尖微芽嫁接脱毒来说具有重要的价值，且其耗时短，操作简单易行，可以预先降低茎尖材料的带毒率，为提高无病毒苗木脱毒率提供了更为有效的茎尖材料。鉴于常规嫁接繁殖同样依赖于低病原滴度的健康接穗材料，利用化合物预处理接穗，并结合分子检测技术，可进一步优化健康苗木的获得率。因此，本发明提供的技术方案为柑橘无病良种繁育获得健康苗木提供了新途径。
1.靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1具体还包括：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2具体还包括：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s3具体还包括：采用等温滴定量热法测定各候选化合物与纯化蛋白murd的结合常数ka。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，候选化合物溶液浓度50-500μm，murd蛋白溶液浓度20-50μm；等温滴定量热法的参数设置包括：滴数10，每滴时间间隔120s，功率10μcal/s，搅拌器转速250r/min。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳性接穗的长度6-8个节位/条，将待验证的所述步骤s3筛选所得的化合物配置为50-200μm浓度的溶液，将处理好的阳性接穗扦插于配制好的含有1/3泥碳，1/3蛭石，1/3土壤的培养基中；扦插容器为高9cm,长7.5cm,宽7.5cm的pc材料制备的培养盒；使用含有50-200μm待验证化合物的1/4ms培养液进行喷施处理，每3d喷施一次，一次喷施10ml；在26±1℃恒温、光照强度4000lx、光照与黑暗各12h交替的条件下进行培养。
8.靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物，其特征在于，由权利要求1-7中任一项所述的筛选方法筛选获得。
9.如权利要求8所述的抗黄龙病化合物，其特征在于，包括：nilofabicin、pa-824或afn-1252。
10.靶向韧皮部杆菌murd的抗黄龙病化合物在防治黄龙病中的应用，其特征在于，所述抗黄龙病化合物由权利要求1-7中任一项所述的筛选方法筛选获得，和/或，所述抗黄龙病化合物包括nilofabicin、pa-824或afn-1252。
