本发明涉及类器官领域，具体涉及胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，还涉及利用共培养在化疗药物筛选中的应用。
背景技术：
1、
2、近年来，随着细胞培养技术的改进，以干细胞驱动而自我组装构建形成的类器官模型培养取得成功，特别是以人源肿瘤细胞构建的肿瘤类器官（patient-derived tumororganoids，pdos）模型，因其能在体外重现肿瘤结构及其遗传学特征而被广泛应用于肿瘤生物学基础研究及临床精准治疗等多个领域。然而，肿瘤微环境是由肿瘤细胞和间质细胞组成的复杂体系，常规的pdos仅包含了恶性肿瘤细胞，忽略了间质细胞对肿瘤细胞生长以及化疗耐药的影响。
3、癌症相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，cafs)作为肿瘤微环境中间质细胞的重要组成部分，其不仅参与支持肿瘤细胞的生长，而且介导肿瘤细胞的化疗耐药与免疫逃逸。目前，尽管在消化道肿瘤如结直肠癌的研究中已建立了cafs与pdos的共培养体系以探索cafs对pdos的影响，但关于胃癌患者来源的pdos与cafs的共培养仍鲜有研究。特别是肿瘤微环境中的cafs具有异质性，关于共培养体系中能够影响pdos生物学功能的cafs属于哪个细胞亚群尚未见相关报道。因此，构建胃癌cafs与pdos的共培养体系并明确其中cafs的具体细胞亚群属性，有助于探索cafs亚群对pdos生长和耐药的影响，有利于体外开展药物的筛选及新药研发。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法；本发明的目的之二在于提供胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养用于化疗药物筛选中的应用。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、1、胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，将胃癌类器官单细胞悬液与胃癌相关肌成纤维细胞单细胞悬液按照数目比为1:1比例混合，然后加入基质胶，混匀后放入co2细胞培养箱使基质胶凝固，最后加入胃癌类器官培养基（biogeneous, k2179-gc）培养。
4、本发明优选的，所述胃癌相关肌成纤维单细胞悬液的制备方法如下：取胃癌患者手术切除组织标本，用组织保存液保存，剪碎后加入肿瘤组织消化液1中进行消化，过滤收集滤网上组织小块，随后在co2细胞培养箱中贴壁培养，加入dmem完全培养基继续培养，获得胃癌相关成纤维细胞并进行鉴定，最后将鉴定获得的胃癌相关肌成纤维细胞用胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液。
5、本发明优选的，所述加入肿瘤组织消化液1中进行消化是加入含有1mg/mlcollagenase iv和100μg/ml dnase ⅰ的dmem培养基放入37℃恒温摇床以转速为14r/min进行消化，60min后终止消化。
6、本发明优选的，所述过滤是用70μm滤器过滤。
7、本发明优选的，所述用胰蛋白酶消化是加入胰蛋白酶至质量分数为0.25%，于37℃孵育1-2min，然后加入相当于胰蛋白酶体积3-5倍的dmem完全培养基终止消化。
8、本发明优选的，所述胃癌类器官单细胞悬液的制备方法如下：取胃癌患者手术切除组织标本，剪碎后加入肿瘤组织消化液2（biogeneous, k601003）中进行消化至散落细胞团，加入dmem完全培养基终止消化，吹打组织消化液，40μm滤器过滤收集滤过液，将滤液离心收集沉淀，沉淀加入胃癌类器官培养基重悬，随后加入bme基质胶混匀，放入co2细胞培养箱使基质胶凝固，加入胃癌类器官培养基进行培养，获得胃癌类器官，将获得的类器官消化成单细胞悬液。
9、本发明优选的，所述消化成单细胞悬液是将获得的胃癌类器官用pbs清洗2遍，用0.1%bsa润洗枪头，加入tryple express酶溶液轻柔吹打，放入co2细胞培养箱孵育消化，每隔5min取出观察并轻柔吹打1次，直至大部分类器官消化成单细胞后加入相当于trypleexpress酶溶液5倍体积的advanced dmem/f-12培养基终止消化，获得类器官单细胞悬液。
10、本发明的有益效果在于：本发明提供了胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，采用了含primocin抗生素的组织保存液运送组织，并采用含青霉素-链霉素的dmem培养基清洗组织，有效的地减少了组织处理过程中出现的微生物污染，同时组织全程都处在培养基的环境中，良好的维持了细胞在体外的活性，有利于提高成纤维细胞和类器官培养的成功率。
11、本发明还通过培养获得的胃癌相关成纤维细胞，通过形态学和荧光抗体染色鉴定属于肌成纤维细胞，明确了与胃癌类器官共培养的成纤维细胞的具体细胞亚群属性。
12、本发明构建的人胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞共培养体系，采取的是类器官与成纤维细胞直接接触培养的方式，近似模拟肿瘤细胞周围的成纤维细胞浸润，更好地反映了肿瘤微环境中成纤维细胞与肿瘤细胞间的相互作用。
13、本发明构建的人胃癌类器官与胃癌相关成纤维细胞共培养体系，可直接加入荧光染料hoechst和caspase3/7对细胞进行染色，直接观察并量化胃癌类器官经药物处理后的细胞活性。
14、本发明构建的共培养体系中胃癌类器官的生长速度更快，对化疗药物的抵抗性更强，更好地模拟了胃癌患者体内肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，可成为肿瘤患者个体化治疗药物的筛选平台。
1.胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：将胃癌类器官单细胞悬液与胃癌相关肌成纤维细胞单细胞悬液按照数目比为1:1比例混合，然后加入基质胶，混匀后放入co2细胞培养箱使基质胶凝固，最后加入胃癌类器官培养基培养。
2.根据权利要求1所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于，所述胃癌相关成肌纤维单细胞悬液的制备方法如下：取胃癌患者手术切除组织标本，用组织保存液保存，剪碎后加入肿瘤组织消化液1中进行消化，过滤收集滤网上组织小块，随后在co2细胞培养箱中贴壁培养，加入dmem完全培养基继续培养，获得胃癌相关成纤维细胞并进行鉴定，最后将鉴定获得的胃癌相关肌成纤维细胞用胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液；
3.dmem完全培养基：dmem basic基础培养基、10%的胎牛血清、1％的glutamax和1％的p/s、100iu青霉素和100ug/ml链霉素。
4.根据权利要求2所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：所述加入肿瘤组织消化液1中进行消化是加入含有1mg/ml collagenase iv和100μg/mldnase ⅰ的dmem培养基放入37℃恒温摇床以转速为14r/min进行消化，60min后终止消化。
5.根据权利要求2所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：所述过滤是用70μm滤器过滤。
6.根据权利要求2所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：所述用胰蛋白酶消化是加入胰蛋白酶至质量分数为0.25%，于37℃孵育1-2min，然后加入相当于胰蛋白酶体积3-5倍的dmem完全培养基终止消化。
7.根据权利要求1所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：所述胃癌类器官单细胞悬液的制备方法如下：取胃癌患者手术切除组织标本，剪碎后加入biogeneous肿瘤组织消化液中进行消化至散落细胞团，加入dmem完全培养基，吹打组织消化液，40μm滤器过滤收集滤过液，将滤液离心收集沉淀，沉淀加入胃癌类器官培养基重悬，随后加入bme基质胶混匀，放入co2细胞培养箱使基质胶凝固，加入胃癌类器官培养基进行培养，获得胃癌类器官，将获得的类器官消化成单细胞悬液。
8.根据权利要求6所述胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养方法，其特征在于：所述消化成单细胞悬液是将获得的胃癌类器官用pbs清洗2遍，用0.1%bsa润洗枪头，加入tryple express酶溶液轻柔吹打，放入co2细胞培养箱孵育消化，每隔5min取出观察并轻柔吹打1次，直至大部分类器官消化成单细胞后加入相当于tryple express酶溶液5倍体积的advanced dmem/f-12培养基终止消化，获得类器官单细胞悬液。
9.胃癌类器官与胃癌相关肌成纤维细胞的共培养用于化疗药物筛选中的应用。
