本发明涉及基因测序，具体为一种基于修饰tn5的甲基化目标区域捕获测序文库的构建方法及其应用。
背景技术：
1、dna甲基化是一种重要的表观遗传修饰，通过dna甲基转移酶在特定碱基上选择性地添加甲基，从而形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)和其他少量的甲基化结构。这种化学修饰可以在不改变dna序列的情况下改变遗传表现，在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、胚胎发育以及人类肿瘤发生中发挥着重要作用。不同细胞类型和组织中的dna甲基化水平具有一定差异，这种差异可以影响基因的表达和功能。因此，研究人员通过整合dna甲基化与其他组学内容，以期揭示疾病发生的分子机制，并发现潜在的早筛标志物。
2、近年来，各类癌症对于人类健康的威胁程度愈发严重。与正常细胞相比，癌细胞的基因组甲基化水平整体偏低，但其基因的启动子区域呈现出高甲基化趋势。人类基因组研究指出，肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化水平能够通过改变染色质结构、dna构象及dna-蛋白质互作方式来抑制抑癌基因的表达，细胞失去抑癌功能后会重新进入生长周期，最终导致肿瘤的形成。
3、现阶段，人们往往通过检测某些癌细胞或组织中特征性甲基化结构的改变来预防肿瘤的发生。dna甲基化研究的主要方法包括亚硫酸氢盐测序法、限制性内切酶测序法以及亲和富集法等，其中亚硫酸氢盐测序法是目前公认的dna甲基化测序“金标准”，由亚硫酸氢盐处理过的dna，其基因组上未甲基化的c会转化为胸腺嘧啶(t)，而甲基化的c保持不变，pcr扩增后对产物进行测序，比较测序结果与未处理序列即可确定dna序列中甲基化位点。
4、尽管全基因组亚硫酸氢盐测序可以实现高分辨率且全面的甲基化模式检测，但受制于文库构建时的高起始量dna，部分样本并不适用。
5、因此有必要设计一种甲基化捕获测序文库的构建方法，适用低起始量的dna的测序，并满足甲基化捕获的要求。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于修饰tn5的甲基化目标区域捕获测序文库的构建方法及其应用，以适用低起始量的dna的测序，并满足甲基化捕获的要求。
2、有鉴于此，本发明的方案为：
3、本发明的第一个方面在于，提出甲基化捕获测序文库的构建方法，步骤包括：
4、将带有双端标签的测序接头包埋进tn5转座酶中组建tn5转座子；
5、使用组建好的tn5转座子分别对若干样本基因组dna进行片段化，得到包含不同标签的各样本片段化产物；
6、对各样本片段化产物进行末端补平与修复；
7、将修复后的各产物进行等量混合，加入封阻引物杂交；
8、产物进行转化处理，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
9、将转化后的dna进行pcr扩增得到甲基化捕获的测序文库。
10、进一步地，所述测序接头包括核苷酸序列如seq id no：1所示的第一接头、核苷酸序列如seq id no：2所示的第二接头，及核苷酸序列seq id no：3所示的第三接头；第二接头、第三接头中的碱基c均甲基化修饰。
11、优选地，其特征在于，所述tn5转座子组建过程使用第一引物和第二引物，引物中所有碱基c均甲基化修饰；第一引物选自核苷酸序列如seq id no：4-6所示的任意一种，第二引物选自核苷酸序列如seq id no：7-14所示的引物任意一种。
12、进一步地，所述样品片段化后使用sds终止，随后加入中和反应试剂，消除sds。
13、进一步地，所述片段化产物修复过程使用klenow酶、t4聚合酶以及四种碱基补平末端，然后用无3’-5’外切活性的klenow酶进行修复。
14、进一步地，所述杂交过程为，将混合后的修复产物浓缩成干粉后加入封阻引物、探针和杂交buffer后进行杂交，杂交完成后使用链霉亲和素磁珠进行吸附并用洗脱试剂进行清洗，去除多余片段及冗余杂质。
15、进一步地，所述pcr扩增时加入核苷酸序列如seq id no：15-16所示的引物。
16、本发明的第二个方面在于，提出所述构建方法得到的甲基化捕获测序文库。
17、本发明的第三个方面在于，提出第二个方面所述甲基化捕获测序文库在非诊断为目的基因甲基化检测中的应用。
18、本发明的第四个方面在于，提出一种测序方法，包括以下步骤：
19、根据第一个方面所述构建方法制备得到甲基化捕获测序文库；
20、对所述甲基化捕获测序文库进行测序，获得测序数据；
21、将所述测序数据与参考基因组数据进行比对，根据比对信息及各文库标签获得各样本基因组dna的甲基化位点。
22、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
23、本发明所述文库构建方法基于tn5转座子的转座特性，直接将修饰的带有双端barcode的测序接头包埋进tn5转座酶中，形成一批带有不同序列标签的tn5转座子；利用不同的tn5转座子对多个样本进行片段化可以使得不同样本携带有不同的序列标签，以达到区分样本的目的，实现多个低起始量样本的混合测序，极大地提高了实验通量；相较于传统的全基因组甲基化测序方法，本发明的优势在于不需要任何复杂精密的仪器，常规实验器材器即可完成所有操作，并且仅仅需要1天时间即可将低起始量样本转变为高质量的待测序样品。
24、本发明可以处理dna起始量为500ng，甚至是400ng的样品，对于dna总量较少的实验样品有着显著优势。此外，该方法需要的dna的起始量低，平均捕获特异性超90％以上，call rate达到99％。
1.甲基化捕获测序文库的构建方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述测序接头包括核苷酸序列如seqid no：1所示的第一接头、核苷酸序列如seq id no：2所示的第二接头，及核苷酸序列seqid no：3所示的第三接头；第二接头、第三接头中的碱基c均甲基化修饰。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述tn5转座子组建过程使用第一引物和第二引物，引物中所有碱基c均甲基化修饰；第一引物选自核苷酸序列如seq id no：4-6所示的任意一种，第二引物选自核苷酸序列如seq id no：7-14所示的引物任意一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述样品片段化后使用sds终止，随后加入中和反应试剂，消除sds。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述片段化产物修复过程使用klenow酶、t4聚合酶以及四种碱基补平末端，然后用无3’-5’外切活性的klenow酶进行修复。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述杂交过程为，将混合后的修复产物浓缩成干粉后加入封阻引物、探针和杂交buffer后进行杂交，杂交完成后使用链霉亲和素磁珠进行吸附并用洗脱试剂进行清洗，去除多余片段及冗余杂质。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pcr扩增时加入核苷酸序列如seqid no：15-16所示的引物。
8.权利要求1-7任意一项所述构建方法得到的甲基化捕获测序文库。
9.权利要求8所述甲基化捕获测序文库在非诊断为目的基因甲基化检测中的应用。
10.一种测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
